2型糖尿病小鼠肝脏中Poldip2表达抑制导致血糖异常的研究

发布时间：2020-04-09 14:46

【摘要】：目的:聚合酶δ相互作用蛋白2(Polymerase delta-interacting protein 2,Poldip2)是在人体中由Poldip2基因编码的酶。它能增加NADPH氧化酶4(NADPH oxidase4,NOX4)的活性。我们认为在KKAy小鼠中Poldip2的增加可以促进过氧化物(Hydrogen Peroxide,H_2 O_2)的产生,改变胰岛素信号通路,尤其是肝脏中的糖代谢和脂代谢,从而改善糖脂水平。本研究的目的是探讨Poldip2在改善血糖水平和抑制KKAy小鼠肝脏糖异生具有潜在的益处。方法:利用特殊的糖尿病模型鼠即KKAy小鼠,将其随机分为磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)组,绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)组和尾静脉注入聚合酶δ相互作用蛋白2(Poldip2)组。C57BL/6J小鼠作为正常对照组。利用Western blot方法探究KKAy小鼠体内Poldip2的蛋白变化情况以及胰岛素信号通路中下游蛋白如蛋白激酶B(Protein kinase,Akt),Forkhead转录因子1(Forkhead box protein O1,FoxO1)及其磷酸化等蛋白表达水平与正常小鼠的差异,以及下游糖异生蛋白调控基因磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK),葡萄糖-6-磷酸酶(Glucose6-phosphatase,G6Pase)表达的变化,并且用RT-PCR再次从RNA水平进一步验证糖异生的关键酶PEPCK,G6Pase的mRNA相对表达水平的变化,同时采用生化试剂盒检测糖尿病小鼠的生化指标,了解其与正常对照组之间存在的差异。结果:(1)与正常对照组C57 BL/6 J小鼠相比,KKAy模型鼠体质量增加明显,差异具有统计学意义(P0.05),KKAy小鼠的空腹血糖水平相较于正常对照组C57BL/6J小鼠明显升高,差异是有统计学意义的(P0.05)。经过干预处理及随机分组后,四组干预1周后体质量均未见明显变化。但Poldip2组干预后空腹血糖水平较干预前得到明显改善(P0.05).四组之间的过氧化物(Hydrogen Peroxide,H_2 O_2)水平差异有统计学意义(F=95.17,P0.05)。与正常对照组C57BL/6J组相比,PBS组和GFP组过氧化氢的水平显著降低(P0.05),而Poldip2组则无明显变化。与正常对照组C57BL/6J小鼠的胰岛素水平相比,PBS组和GFP组的胰岛素水平明显升高(P0.001)。与GFP组和PBS组小鼠相比,Poldip2组的胰岛素水平明显下降(P0.001)。(2)与正常对照组C57 BL/6 J相比,PBS组和GFP组Poldip2的蛋白表达被显著抑制(P0.05),而与PBS组和GFP组相比,Poldip2组的Poldip2表达水平明显上升(P0.05)。与正常对照组C57 BL/6 J小鼠相比,PBS组和GFP组的Catalase蛋白表达水平明显下降(P0.05),但Poldip2组Catalase蛋白活性与正常对照组相比无明显变化。与正常对照组C57 BL/6 J小鼠相比,PBS组和GFP组的磷酸化10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源(phospho-Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)与PTEN的比值显著降低(P0.05),PTEN明显上升(P0.05)。与PBS组、GFP组相比,Poldip2组中p-PTEN与PTEN的比值升高至正常水平。(3)与正常对照组C57 BL/6 J小鼠相比,PBS组和GFP组的Rictor活性明显下降(P0.05),而Poldip2组的则无明显的变化。与正常对照组C57 BL/6 J小鼠相比,其余3组中总Akt蛋白表达水平无明显变化,但PBS组和GFP组中Akt的丝氨酸473位点磷酸化(p-Akt473)和Akt的苏氨酸308位点磷酸化(p-Akt308)的表达显著降低(P0.05),Poldip2组的p-Akt473和p-Akt308则上升至正常水平。PBS组和GFP组的p-FoxO1与FoxO1的比值显著低于对照组C57 BL/6 J小鼠(P0.05),但Poldip2组的比值则无明显变化。(4)与正常对照组C57 BL/6 J小鼠相比,PBS组和GFP组中的PEPCK和G6Pase表达水平明显升高(P0.05)。而与PBS组、GFP组相比,Poldip2组中的PEPCK和G6Pase显著降低(P0.05)。(5)通过RT-PCR中可以了解这四组肝脏中PEPCK和G6Pase的mRNA表达。与正常对照组C57 BL/6 J组相比,PBS组和GFP组PEPCK和G6Pase mRNA表达水平显著升高(P0.05),但Poldip2组的mRNA表达水平却无明显变化。与PBS组和GFP组相比,Poldip2组的PEPCK和G6Pase mRNA表达水平明显降低(P0.05)。RT-PCR的结果与Western blot相一致。结论:1.Poldip2对于2型糖尿病肝脏的胰岛素抵抗有改善作用,并在血糖代谢调节中可能起到一定的作用。2.Poldip2能够改善小鼠的糖代谢,机制可能是通过升高Poldip2的表达,激活NOX4从而产生H2O2,过度氧化抑制了PTEN的活性,进而激活Akt的活性,改善了胰岛素信号通路及糖代谢的紊乱。
【图文】：

肝脏,空腹血糖水平,统计学意义,小鼠

组 C57BL/6J 小鼠的体质量（28.91±0.72）g 相比， KKAy 小鼠体质量增加明显，两者之间的差异是有统计学意义的（ P<0.05）；空腹血糖水平 KKAy 小鼠的为（9.57±0.47）mmol/ L 相较于正常对照组 C57BL/6J 小鼠的空腹血糖（6.41±0.20）mmol/ L 相比明显升高，差异具有统计学意义（ P<0.05）。之后根据处理不同分为 4 组进行干预 1 周。而对于各组，干预 1 周后体质量均未见明显变化。干预前空腹血糖水平 Poldip2 组为（9.78±0.29）mmol/L，，在干预后的 Poldip2 组空腹血糖水平为：（8.64±0.28）mmol/L，两者差异具有统计学意义（P<0.05），说明 Poldip2可能具有降低 KKAy 的血糖水平的作用。3.2 肝脏 H2O2的检测从小鼠新鲜肝脏中测 H2O2水平，四组之间的 H2O2水平差异有统计学意义（F=95.17，P<0.05)。与正常对照组 C57BL/6J 组相比，PBS 组和 GFP 组的水平显著降低（P<0.05），而 Poidip2 组则无明显变化。见图 1。

蛋白,小鼠

24图 2.通过 Western blot 分析 C57BL/6J 正常对照组和 KKAy 小鼠的蛋白Poldip2，Catalase， PTEN 及 p- PTEN 的蛋白表达水平，并以 β- actin 为内参照。Fig2. The protein expressions of Poldip2，Catalase，PTEN and p-PTEN in C57BL/6 Jwhich is normal control group and KKAy mice were analyzed by Western blot，and β-actin was used as internal reference.注：1 代表正常对照组，2 代表 KKAy 中的 PBS 组，3 代表 KKAy 中的 GFP 组，4 代表 KKAy中的 Poldip2 组。 * 与正常对照组比较，P<0.05。Note：1 as normal control group，2 as PBS group in the KKAy mice,3 as GFP group in the KKAymice，3 as Poldip2 group in the KKAy mice.* as compared with normal control group， P<0.05.3.4.2 肝脏组织中 Akt、Rictor、FoxO1 及 p-FoxO1 的表达
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.1

【参考文献】