胸腺萎缩与炎性衰老的关系以及miRNA-146a-5p在其中的作用研究

发布时间：2020-04-11 03:28

【摘要】：目的:胸腺是人体重要的免疫器官,来自骨髓的淋巴造血祖细胞在胸腺中与胸腺基质细胞相互作用,进而分化、发育、成熟为T淋巴细胞。胸腺随着年龄增长而发生萎缩,能引起免疫系统衰老和免疫应答功能低下,增加了老年人罹患癌症、自身免疫性疾病以及感染等老年病的风险。而这些严重的老年病可能伴有一种慢性低度炎症状态,称为炎性衰老。炎性衰老被认为是免疫衰老的一个最显著的后果,但其发生与胸腺萎缩的直接关系目前尚不明确。了解胸腺萎缩的分子机制,以及胸腺萎缩与炎性衰老的关系,将会为减轻炎性衰老,提高老龄人口健康水平提供理论基础。研究方法:一、构建衰老模型,探索老化鼠是否存在炎性衰老,以及炎性衰老与胸腺萎缩的可能关系。1、模型构建:2月龄C57BL/6雌性小鼠颈背部皮下注射不同剂量D-半乳糖(D-gal),持续8周,筛选出致胸腺明显萎缩(与18-20月龄自然老化鼠对比)的剂量进行后续实验;2、免疫衰老指标测定:流式细胞术检测脾脏CD4~+CD8~-CD25~+Foxp3~+调节T细胞(pTreg)水平;3、炎性衰老指标测定:流式细胞术检测血液衰老细胞CD3~+CD8~+CD28~-T细胞水平,检测脾脏炎性细胞CD3~+CD4~+TNF-α~+T细胞水平;ELISA检测血清中IL-6水平;HE染色检测肺的炎性细胞浸润情况;4、胸腺自身反应性T细胞前体水平测定:流式细胞术检测脾脏CD4~+CD44~(hi)Ki67~+和CD8~+CD44~(hi)Ki67~+T淋巴细胞动态水平;5、胸腺阴性选择功能评价:流式细胞术检测胸腺CD4~+CD8~+、CD4~+、CD8~+淋巴细胞及胸腺Treg(tTreg)细胞水平;Western blot检测胸腺Aire蛋白水平。二、探索miRNA-146a-5p在原代胸腺基质细胞成熟前衰老中的可能作用。1、原代胸腺基质细胞培养:取出生3天以内的C57BL/6小鼠胸腺,提取并培养胸腺基质细胞;2、探索D-半乳糖致胸腺基质细胞成熟前衰老情况:用不同浓度梯度(0-225mM)D-半乳糖,设置不同时间梯度(24h,48,72h)对胸腺基质细胞进行处理,细胞增殖实验(MTS)检测细胞增殖及活力;流式细胞术检测细胞活性氧(ROS)水平;流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期;衰老相关(SA)-β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老;Western blot检测衰老相关蛋白p16,p21,p53表达水平,检测自噬活性相关蛋白LC3,p62,mTOR水平;3、胸腺基质细胞发生成熟前衰老时miRNA-146a-5p水平测定:Real Time PCR检测细胞miRNA-146a-5p水平;4、探索miRNA-146a-5p对胸腺基质细胞成熟前衰老的影响:用lipo RNA~(imax)将miRNA-146a-5p mimic或Negative Control(NC)转染至胸腺基质细胞,Real Time PCR检测转染效率;用miRNA-146a-5p mimic和/或D-半乳糖处理胸腺基质细胞,用上述方法检测细胞活力,细胞凋亡、细胞周期,SA-β半乳糖苷酶水平,检测衰老相关蛋白及自噬相关蛋白水平;5、miRNA-146a-5p对胸腺基质细胞成熟前衰老影响的可能机制:Western blot检测自噬相关蛋白水平,检测miRNA-146a靶基因TNF受体相关因子6(TRAF6)水平。结果:一、老化鼠存在炎性衰老,且胸腺萎缩能直接加重炎性衰老。1、大剂量的D-半乳糖能诱导小鼠衰老并导致胸腺明显萎缩,且胸腺萎缩情况及胸腺总细胞数的减少与自然老化鼠(18-20月龄)相当;2、老化鼠出现免疫衰老:pTreg细胞比例增加;3、老化鼠出现炎性衰老改变:外周衰老细胞(CD3~+CD8~+CD28~-T细胞)比例增加,外周CD3~+CD4~+TNF-α~+炎性T淋巴细胞比例增加,血液IL-6水平增加,肺部炎性细胞浸润;4、老化鼠的自身反应性T细胞前体(CD4~+CD44~(hi)Ki67~+和CD8~+CD44~(hi)Ki67~+T细胞)比例增加;5、老化鼠胸腺阴性选择功能受损:胸腺CD4CD8双阳性淋巴细胞比例减少、CD4、CD8单阳性淋巴细胞比例增加,胸腺tTreg细胞比例增加;6、老化鼠胸腺Aire蛋白表达降低;二、miR-146a-5p能缓解D-半乳糖诱导的原代胸腺基质细胞成熟前衰老。1、225mM的D-半乳糖处理48小时能使胸腺基质细胞活力明显下降;2、225mM的D-半乳糖处理48小时能使胸腺基质细胞ROS明显增加;3、D-半乳糖能诱导原代胸腺基质细胞发生成熟前衰老:0-225mM的D-半乳糖处理胸腺基质细胞48小时,细胞凋亡未发生明显变化,但能使胸腺基质细胞周期阻滞在G2期,能使SA-β-半乳糖苷酶水平逐渐增加,能使细胞衰老相关蛋白p53,p16,p21逐渐增加,能使自噬活性相关蛋白LC3II/LC3I降低,p62蛋白增加,mTOR蛋白水平增加;4、胸腺基质细胞发生成熟前衰老时,miRNA-146-5p减少;5、过表达miRNA-146a-5p能减轻胸腺基质细胞的成熟前衰老:过表达miRNA-146a-5p能逆转胸腺基质细胞发生成熟前衰老时的细胞活力降低;能使细胞周期阻滞缓解;能降低SA-半乳糖苷酶水平;能降低衰老相关蛋白水平;6、miRNA-146a-5p不能逆转胸腺基质细胞发生成熟前衰老时的自噬活性降低;7、miRNA-146a-5p能逆转胸腺基质细胞发生成熟前衰老时的TRAF6的升高。结论:1、老化鼠存在炎性衰老状态;2、胸腺萎缩后,阴性选择受损,外周自身反应性T细胞前体增加,可直接加重炎性衰老;3、胸腺基质细胞对ROS刺激较敏感,随着ROS增加会出现成熟前衰老;4、过表达miR-146a-5p能减轻胸腺基质细胞的成熟前衰老;5、miRNA-146a-5p可能对延缓胸腺萎缩有作用,从而减轻炎性衰老。
【图文】：

-半乳糖能诱导C57/BL6小鼠衰老和胸腺萎缩分别用不同剂量的D-半乳糖连续颈背部皮下注射60天后，D-半乳糖组(200，500，1000mg/kg/d)、青年对照组(4mo-old)、媒介对照组(NS)和自然老化(18-20mo-old，Aged)小鼠(A)血清MDA含量；(B)血清SOD活性；(C)胸腺大体图像；(D)胸腺指数（胸腺重量/10g体重）；(E)胸腺总细胞绝对计数

脾脏,D-半乳糖,细胞,炎性

图 2. D-半乳糖诱导 C57/BL6 小鼠出现免疫衰老分别用不同剂量的 D-半乳糖连续颈背部皮下注射 60 天后，(A)流式细胞术检测各组小鼠脾脏pTreg 细胞在脾脏 CD4 阳性细胞群中比例；(B) pTreg 细胞在脾脏 CD4 阳性 T 淋巴细胞中所占的比例统计。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. Con and NS。3.3 老化鼠出现炎性衰老改变接下来，为了明确老化鼠是否存在炎性衰老状态，我们对老化鼠（自然老化鼠与 D-半乳糖快速老化鼠）的炎性衰老指标进行检测。如图 3A 和 3B 所示，与“年轻”对照及 NS 组相比，500 及 1000mg/kg/d 的 D-半乳糖能提高小鼠血液中衰老细胞（CD3+CD8+CD28-T 淋巴细胞）在 CD3 阳性 T 细胞群的比例，其中 1000mg/kg/d 引起的提高与自然老化鼠相似。除此之外，老化鼠的外周（脾脏）炎性 T 细胞（CD3+CD4+TNF-α+细胞）在脾脏 CD4 阳性细胞群中的比例增加（图 3C 和 3D）。炎性衰老的主要改变还包括血清 IL-6 水平的变化，因此我们对血清 IL-6 进行检测，，
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R583

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