肠道菌群与宿主血糖代谢相关性的初步研究

发布时间：2020-04-16 01:08

【摘要】：随着对肠道菌群领域的深入研究,许多证据表明,肠道菌群与宿主的肥胖、高血压、糖尿病等慢性病高度相关,人们正在从以前被忽视了的肠道菌群角度研究这些慢性病的起源、发展与防控策略,有望为慢性病防控带来新思路。在国内外这些研究以及自身验证的基础上,我们实验室于2013年提出“饥饿源于菌群”的科学假说,并通过大量研究形成“柔性辟谷”技术,通过连续7-14日服用复合益生元减少和消除人体饥饿感,让人体进入到模拟禁食状态,有助于人体将肠道菌群恢复正常状态,为从源头上改善慢性病提供了参考思路。自该技术提出以来,已陆续与多家医院合作完成相关临床研究,在生理性减重及改善多种慢性病上获得良好效果。为进一步研究柔性辟谷技术对肥胖人群高血糖等慢性病指标改善的效果,本文首先通过与太原市第二人民医院营养科展开合作,招募志愿者体验为期一周的柔性辟谷技术改善肥胖人群高血糖等慢性病问题的研究,并在干预开始前后检测并记录志愿者的相关生理生化指标,利用统计学软件SPSS 16.0进行数据统计分析,利用GraphPad Prism 6.0进行绘图。结果表明,柔性辟谷一周后与干预前相比,志愿者的体重、BMI、内脏脂肪量及体脂肪显著下降(P0.01),舒张压(P=0.003)、收缩压(P=0.045)、空腹血糖(P=0.001)、空腹胰岛素水平(P=0.000)也均显著下降,而肾功、肝功及电解质等指标均在正常值范围内略有波动,说明柔性辟谷技术不仅能对高血糖等慢性病的不良指标有改善作用,而且具有良好的安全性。根据此次柔性辟谷对空腹血糖和空腹胰岛素这两个血糖代谢指标的改善作用,结合实验室以往有关柔性辟谷的研究结果(改善志愿者的肠道微生态,特异性增长有益菌如乳酸杆菌、双歧杆菌),推测血糖代谢指标的改善与肠道微生态的改善有关。为进一步研究其中的相关性,我们设计利用复合抗生素建立小鼠肠道微生态紊乱模型,从而观察肠道微生态对小鼠血糖代谢调控的影响。在此假设的基础上,首先,我们选取C57、BALB/c、CD1和KM四种常见品系小鼠进行口服葡萄糖耐受量测试(OGTT)(15%葡萄糖溶液,0.2mL每只小鼠),并利用Origin 8.0软件对小鼠不同时间点(0,5,10,15,30,60,120 min)的血糖值进行曲线拟合。研究结果发现,小鼠的糖代谢曲线均在15min左右达到顶峰,在120min左右恢复正常,且均符合Giddings数学模型(R~2≥0.95)即y=y0+_W~A√_X~(Xc)I1(_W~(2√XcX)e_W~(-X-Xc)),说明选取的4种品系小鼠对口服葡萄糖耐受有较好的一致性。随后,我们选取在上述口服葡萄糖耐量实验中对糖水高敏感度的C57小鼠为对象进行深入研究。具体过程为,将90只18-22g的雄性C57小鼠随机分为6组,分别是“生理盐水+普通饲料组”、“抗生素+普通饲料组”、“生理盐水+高脂饲料组”、“抗生素+高脂饲料组”、“生理盐水+高葡萄糖饲料组”和“抗生素+高葡萄糖饲料组”。所有小鼠在实验开始前在普通实验环境下预先饲养一周(正常饮食、饮水)以便适应环境,随后按照设计好的分组方式进行复合抗生素(参考文献报道选用青霉素、万古霉素、甲硝唑、新霉素)和不同饲料持续干预4周。采用常规方法测小鼠体重、血糖;采用酶联免疫法测小鼠血清胰岛素、组胺、肾上腺素水平;口服葡萄糖耐受量测试测小鼠糖耐量后利用Origin 8.0软件进行曲线拟合,分析动物血糖变化特征。结果显示,在复合抗生素干预下,小鼠血糖水平显著降低(P=0.000),同时导致小鼠葡萄糖耐受量变化趋势有所偏离Giddings曲线(R~20.95),但不同饲料(普通饲料、高脂饲料和高葡萄糖饲料)干预对小鼠血糖水平和葡萄糖耐受量曲线无明显影响。多因素方差分析结果显示,在小鼠体重、胰岛素、组胺水平上,抗生素与饲料干预无交互作用,抗生素与生理盐水组间无统计学差异,不同饲料分组之间有统计学差异。与普通饲料组相比,高脂饲料组的血清胰岛素水平、血清组胺水平显著降低(P=0.000,P=0.033),体重无统计学差异。与普通饲料组相比,高葡萄糖饲料组体重显著降低(P=0.012),血清组胺水平显著升高(P=0.002),血清胰岛素水平无统计学差异。与高脂饲料组相比,高葡萄糖饲料组体重显著降低(P=0.000),血清胰岛素水平、血清组胺水平显著升高(P=0.000,P=0.000)。抗生素与饲料干预在肾上腺素水平上具有交互作用(P0.05),不同饲料组间抗生素组与生理盐水组的肾上腺素水平均有统计学差异,其中普通饲料组与高葡萄糖饲料组内抗生素干预引起肾上腺素水平显著降低(P=0.008,P=0.013),而高脂饲料组内抗生素干预引起肾上腺素水平显著上升(P=0.007)。为了研究肠道菌群在抗生素导致小鼠血糖代谢前后改变情况,我们利用16S rRNA测序技术对各组小鼠粪便样本进行分析,并通过对译出信息剪切过滤,分别进行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类,物种注释以及丰度分析,反映各组小鼠肠道菌群的分布特征变化。从稀释曲线(Rarefaction Curve)及等级聚类曲线(Rank Abundance)的分析结果可见,抗生素处理组的菌群丰富度比生理盐水组显著降低。可观测物种数(Observed Species)和Shannon指数结果显示,抗生素组内物种多样性和菌群丰富度显著低于对应的生理盐水组。主坐标分析(PCoA)及主成分分析(PCA)结果显示,抗生素组与生理盐水组之间存在显著的肠道菌群聚类差异。采用t-检验以及MetaStat法进行统计分析结果显示,在门水平上,使用抗生素可导致含致病菌和机会致病菌的变形菌门的相对丰度显著升高(P0.01),并导致厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门等正常肠道菌群内优势菌门相对丰度的显著降低(P0.01)。在属水平上,“抗生素+普通饲料组”对比“生理盐水+普通饲料组”结果显示,除乳杆菌属(Lactobacillus)和Roseburia外,其余菌属间均具有统计学差异(P0.01),其中,抗生素干预导致克雷伯氏菌(Klebsiella)、Parasutterella、阿克曼氏菌(Akkermansia)相对丰度增多,其余菌属相对丰度减少。“抗生素+高脂饲料组”对比“生理盐水+高脂饲料组”结果显示,除阿克曼氏菌(Akkermansia)、Dubosiella、Alloprevotella、Mucispirillum菌属不具有统计学差异外,其余均具有统计学差异(P0.05或P0.01),其中,抗生素干预除引起Parasutterella相对丰度增加外,其余菌属相对丰度均减少。“抗生素+高葡萄糖饲料组”对比“生理盐水+高葡萄糖饲料组”结果显示,除双歧杆菌属(Bifidobacterium)和Roseburia外,其余菌属间均具有统计学差异(P0.05或P0.01),其中,抗生素干预除引起克雷伯氏菌(Klebsiella)、Parasutterella、阿克曼氏菌(Akkermansia)相对丰度增多,其余菌属相对丰度减少。此外,在无抗生素干预的各饲料组之间某些菌种的丰度也存在统计学差异。在门水平上,相比“生理盐水+普通饲料组”,“生理盐水+高脂饲料组”的变形菌门丰度显著升高(P=0.021)。相比“生理盐水+普通饲料组”,“生理盐水高+葡萄糖饲料组”未鉴定或未分类菌群(unidentified_Bacteria)和柔膜菌门丰度显著升高(P=0.037,P=0.005)。相比“生理盐水+高脂饲料组”,“生理盐水+高葡萄糖饲料组”的拟杆菌门、未分类菌群(unidentified_Bacteria)和柔膜菌门丰度显著升高(P=0.024,P=0.035,P=0.004)。在属水平上,相比“生理盐水+普通饲料组”,“生理盐水+高脂饲料组”的Dubosiella、Odoribacter、Butryicimonas、Oscillibacter、Parabacteroides均显著降低(P0.05),单胞菌属(Stenotrophomonas)显著升高(P=0.038)。相比“生理盐水+普通饲料组”,“生理盐水+高葡萄糖饲料组”的Intesinimonas、Odoribacter、Anaerotuncus、Candidatus_Saccharimonas、Bilophila、Enterorhabdus均显著升高(P0.05),Dubosiella显著降低(P=0.023)。相比“生理盐水+高脂饲料组”,“生理盐水高+葡萄糖饲料组”的Dubosiella、unidentified_Ruminococcaceae、Alistipes、Intestinimonas、Odoribacter、Candidatus_Saccharimonas、Butyricimonas、Oscillibacter、瘤胃球菌(Ruminiclostridium)、Tyzzerella均显著升高。由此可见,复合抗生素的使用引起小鼠随机血糖的降低,导致C57小鼠的葡萄糖耐受量曲线偏离Giddings曲线模型(R~20.95),可能是由于复合抗生素(青霉素、万古霉素、甲硝唑、新霉素)非特异、无选择性地清除了肠道菌群,降低了菌群多样性与相对丰度,从而降低了肠道菌群对食物的吸收转化利用率所导致的。同时,本研究所发现的阿克曼氏菌(Akkermansia)在复合抗生素干预之后出现了增长变化,结合已有文献来看,阿克曼氏菌(Akkermansia)会通过负向调节IFN-γ,改善宿主的葡萄糖耐量,降低宿主的血糖水平。本次实验通过利用复合抗生素作为肠道菌群的负调控因素,改变了肠道微生态,提示肠道菌群与宿主血糖代谢调控之间存在相关性,但是其中的具体关系还需要深入研究。综上所述,本研究进一步论证了柔性辟谷技术能够安全有效地降低志愿者的空腹血糖和空腹胰岛素水平,改善肥胖和高血糖等慢性病指标。结合文献和我们实验室相关研究,这一结果可能与柔性辟谷技术改善宿主肠道微生态有关。为了研究肠道菌群与宿主血糖代谢的相关性,通过选取四种常见品系小鼠进行口服葡萄糖耐受量实验,发现各品系小鼠的血糖代谢均符合Giddings曲线模型。选择其中对血糖敏感度较高的C57小鼠作为实验对象,利用复合抗生素对肠道菌群进行干预并结合高脂和高葡萄糖等不同饲料喂养动物,发现抗生素处理组小鼠在肠道菌群丰度、多样性降低、肠道微生态等方面都发生了显著变化(含部分菌群的显著增加),伴随着动物血糖降低,偏离先前的Giddings曲线模型,提示肠道菌群与宿主血糖代谢调控具有密切的相关性,为后续从肠道菌群角度研究宿主血糖代谢调控提供了参考信息。
【图文】：

志愿者,体重变化,柔性,舒张压

图 1. 柔性辟谷期间志愿者每日体重变化情况（n=12）标变化情况指标因数据不全而剔除。其余 8 名志愿者在柔性辟谷愿者柔性辟谷前后，舒张压下降（干预前：95.18±.13mmHg）（P=0.003）、收缩压下降（干预前：137.6410.08mmHg）（P=0.045），，均具有统计学差异。从每日的血压（左为舒张压，右为收缩压）呈稳定的

血压,柔性,日变化,志愿者

图 1. 柔性辟谷期间志愿者每日体重变化情况（n=12）3.2 生理指标变化情况3.2.1 血压指标血压有 4 人因数据不全而剔除。其余 8 名志愿者在柔性辟谷期间未出现低血压现象，8 名志愿者柔性辟谷前后，舒张压下降（干预前：95.18±9.58mmHg，干预后：84.91±7.13mmHg）（P=0.003）、收缩压下降（干预前：137.64±12.51mmHg，干预后：125.6±10.08mmHg）（P=0.045），均具有统计学差异。从图 2 可见，志愿者柔性辟谷期间每日的血压（左为舒张压，右为收缩压）呈稳定的下降状态。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.1

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