紫薯花色苷干预尿酸代谢异常的分子机制研究

发布时间：2020-04-16 00:01

【摘要】：尿酸代谢异常泛指血液中尿酸水平过高,进而在体内沉积并最终引发痛风的病症。其典型代表高尿酸血症(HUA)已发展成为继“高血糖、高血压、高血脂”三高外的“第四高”,在我国呈现“高流行、年轻化”的趋势。尿酸属于人体嘌呤代谢通路的终末产物,其产生过程中受通路上多种生物活性酶的调控。而当人群频繁和大量摄入高嘌呤含量食品时,则会导致大量尿酸生成,超出人体自身代谢能力,引发尿酸代谢异常疾病。目前临床上尚无可以根治尿酸代谢异常疾病的有效手段,包括黄嘌呤氧化酶(XO)抑制剂别嘌呤醇等在内的药物不仅需要长期服用,而且都具有较强的毒副作用,给患者带来较大负担。因此,具有高效低毒特点的天然活性成分,尤其是特殊结构的黄酮类化合物,在营养干预尿酸代谢异常方面有着巨大的潜在市场,也是近些年的热点研究课题。本文旨在探究紫薯花色苷干预尿酸代谢异常的物质基础及分子机制。利用酸醇浸提法、乙酸乙酯萃取法及AB-8大孔吸附树脂制备紫薯花色苷一次纯化物(APSPE),与9种商业不同来源花色苷富集物,比较其对XO抑制活性强弱;进一步利用ODS反向制备填装柱制备不同的紫薯花色苷二次纯化级分,利用高效液相色谱(HPLC)对花色苷成分进行定性定量分析,并基于体外XO抑制实验筛选得到酶活抑制效果最佳的二次纯化级分;在此基础上,利用荧光光谱分析法进一步比较花色苷纯化级分与XO相互作用,对活性最佳的紫薯双酰基花色苷纯化级分(HAA-PSP),采用荧光猝灭光谱法和圆二色谱法系统研究其与XO间的相互作用机制;利用计算机模拟分子对接手段研究紫薯含有的典型分子结构的单体花色苷与XO相互作用的模式,从理论角度深入探究紫薯花色苷分子与XO活性位点相互作用的结合模式,并揭示其抑制XO活性的关键基团;利用HUA小鼠模型,系统评价HAA-PSP体内降尿酸的生物活性,通过研究其对尿酸生成通路关键酶的调控作用,以期揭示紫薯花色苷干预尿酸代谢异常的分子机制;最后,将HAA-PSP与别嘌呤醇按一定浓度进行复配,研究别嘌呤醇和HAA-PSP改善HUA小鼠尿酸水平、肾脏损伤、氧化应激等生理作用的单独和联合效应及机制,探讨HAA-PSP是否能在保证降尿酸治疗效果的前提下,通过减少别嘌呤醇的使用剂量,进而缓解高尿酸血症患者的肾脏炎症及功能性损伤。主要研究结论如下:(1)采用酸醇浸提法及乙酸乙酯萃取法制备紫薯花色苷粗提物,利用AB-8大孔吸附树脂制备得到紫薯花色苷一次纯化物APSPE;在XO活性抑制方面,与市面上的商业不同来源的花色苷富集物相比,APSPE具有明显优势,表现出更为显著的“剂量-效应关系”。APSPE经过ODS纯化获得4个紫薯花色苷纯化级分,pH示差法及HPLC结果显示,级分1主要组分为花色苷辅色素,级分2为分子量900左右的单酰基花色苷,级分3为分子量1100左右的双酰基花色苷,级分4的花色苷含量极低,推测主要为其它杂质成分。活性比较结果显示级分3对XO活性抑制作用最强,级分2效果次之。此部分研究结果表明紫薯花色苷中起主要XO抑制效果的是花色苷组分而非辅色素,且紫薯双酰基花色苷(大分子量)的抑制作用要明显强于单酰基花色苷(小分子量)。(2)利用紫薯花色苷二次纯化级分1、2、3开展荧光猝灭光谱和圆二色谱分析可知,随着花色苷含量的增加,XO固有荧光强度不断降低,说明花色苷纯化级分与XO间存在相互作用。其中级分3,即双酰基花色苷级分(HAA-PSP)对XO的荧光猝灭效果最好。进一步分析相关数据可知,HAA-PSP对XO的荧光猝灭机制为静态猝灭作用,且与XO活性空腔上仅存在单一结合位点。二者的相互作用过程中的主要作用力为疏水相互作用,结合过程可能属于熵驱动的吸热自发反应。由圆二色谱实验结果可知,随着HAA-PSP与XO摩尔比的增加,XO圆二色谱特征峰的椭圆率逐渐降低,表明HAA-PSP能够对XO的二级结构产生影响;其与XO的结合能够使酶的构象发生重排,对其氢键网络结构产生影响,并导致XO的二级结构变得更加致密,限制底物与XO的结合过程,最终导致XO的催化活性降低,对酶活产生了抑制效果。(3)计算机模拟分子对接结果显示,双酰基花色苷结构与XO的结合程度高于单酰基花色苷结构及不含酰基基团的花色苷结构,酰基基团在大分子量花色苷与XO活性中心的识别与结合过程中发挥着重要作用。其中,紫薯花色苷结构中槐糖苷所携带的酰基基团能够有效深入XO活性空腔内部,并与Lys771、Glu802、Glu879、Arg880、Val1011、Pro1012等周围的活性氨基酸残基形成相互作用,除酰基基团外的花色苷其它结构则能够与XO活性通道口附近氨基酸残基产生相互作用并覆盖活性通道口的位置,从两方面同时对底物进入活性空腔与钼喋呤结合的过程产生一定的阻碍作用。紫薯芳香族双酰基花色苷与XO相互作用的驱动力主要为疏水相互作用,同时存在氢键等辅助作用力。此外,酰基基团类型差异对其与XO相互作用所产生的酶活抑制效应有一定的干预和影响,与矢车菊素为母核结构的花色苷分子相比,以芍药素为母核结构的花色苷分子受酰基基团类型的影响和干扰更大。除此之外,咖啡酰相较于阿魏酰等其它基团,属于更优势基团,对花色苷与XO酶的结合起到协助作用。(4)HUA小鼠体内实验结果表明,HAA-PSP能够有效调控HUA小鼠血清尿酸水平,且作用效果明显强于APSPE。在给药期间,HAA-PSP未对小鼠脏器产生明显毒性损伤,且能够显著调节HUA小鼠血清尿素氮和肌酐水平,削弱HUA小鼠的肾脏损伤。与此同时,HAA-PSP又能有效抑制尿酸生成通路关键酶,如黄嘌呤氧化酶(XO)、腺苷脱氨酶(ADA)及5’-核苷酸酶(5’-NT)的活性,能够从源头抑制高尿酸血症小鼠体内尿酸及其前体物的生成,达到降低尿酸水平的效果。(5)将HAA-PSP与别嘌呤醇按一定浓度进行复配再次开展HUA小鼠体内动物实验,结果显示,当HAA-PSP与别嘌呤醇复配共同使用时,其对于HUA小鼠的降尿酸活性与HAA-PSP单独使用相比更显著,推测HAA-PSP可能对别嘌呤醇间存在一定的辅助效应,即能在减少别嘌呤醇的摄入量的同时维持一定的降尿酸活性,达到改善和调节尿酸代谢异常的作用效果。而HAA-PSP与低剂量别嘌呤醇复配使用能够有效缓解HUA小鼠由于高剂量别嘌呤醇使用所造成的肾脏功能性损伤,即表现为小鼠血清尿素氮和肌酐水平的调控及肾脏组织病理学切片观察到的炎性细胞浸润程度的减轻、肾小球及近曲小管的形态学结构恢复到正常化趋势、肾小球基底膜和系膜基质的增生情况得到抑制等现象。此外,HAA-PSP与低剂量别嘌呤醇的联合使用能够有效增强高尿酸血症小鼠体内氧化防御能力,从而缓解由HUA引发的体内氧化应激损伤症状;同时,HAA-PSP与低剂量别嘌呤醇的联合使用能够显著阻碍NF-κB通路的活化过程,减少和抑制炎性细胞因子TNF-α、TGF-β1、白细胞介素家族中的IL-6与IL-1β、黏附分子ICAM-1、环氧合酶COX-2在肾脏中的释放情况,从而减轻高尿酸血症小鼠的肾脏炎症,并有效降低高剂量别嘌呤醇产生的机体不良反应。由此可以推断,HAA-PSP作为天然膳食功能因子,能够在与别嘌呤醇的辅助治疗中有效降低别嘌呤醇的使用剂量,同时缓解药物对患者肾脏产生的额外损伤,从而延缓高尿酸血症患者在治疗过程中引发的慢性肾病的发生与发展。本课题的研究成果期望为膳食花色苷营养干预高尿酸血症、防治尿酸代谢异常提供科学依据。
【图文】：

图 1-1 人体嘌呤合成与代谢通路示意图Fig. 1-1 The purine synthetic and metabolic pathway in human body嘌呤的降解过程主要从脱去氨基开始。在腺苷脱氨酶（ADA）的催化下苷脱去氨基生成次黄嘌呤核苷。鸟嘌呤在鸟嘌呤脱氨酶（GDA）的催化下生成次黄嘌呤。随后，次黄嘌呤和黄嘌呤在 XO 的作用下被氧化生成尿酸（B al 2011）。当人们长期摄入大量富含腺嘌呤和次黄嘌呤的食物时，会促进 ADDA 等脱氨酶及 XO 的活性，产生大量尿酸，导致血清浓度增加。由图 1-，5’-核苷酸酶（5’-NT）主要催化嘌呤核苷酸转化为对应嘌呤核苷（王雪16），ADA 主要介导腺嘌呤核苷转化生成次黄嘌呤核苷的脱氨基过程（安海 2016），二者均能导致过量尿酸前体物质的生成，而 XO 则主要介导最后尿生成过程，，最终导致尿酸水平的升高。因此，针对以上生物酶的抑制和调控为拮抗尿酸代谢异常研究的重要内容。通过抑制生物酶的活性，能够对整个合成通路产生调控作用，进而减少尿酸前体物的生成，间接调控血清尿酸水

图 1-2 人体肾脏尿酸相关转运体Fig. 1-2 Uric acid-related transporters in human kidney谢异常临床治疗手段风急性治疗的药物上秋水仙碱、非甾体抗炎药和甾体类糖皮质激素等药风的发作频率，缓解痛风发作急性期的症状。其中，临床治疗急性痛风和痛风性关节炎的常用及优选药物可以抑制由急性痛风性关节炎引起的关节局部白细胞关节处的尿酸盐晶体的吞噬，减少乳酸、溶酶体等的的附着，从而消除关节炎症及肿胀、急性痛风性关节尿酸血症治疗的药物机制，目前高尿酸血症临床治疗药物主要包括促尿酸
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R589.7;TS264.4


本文编号：2629145