自噬在葛根素促成骨细胞增殖、分化和矿化中的作用
发布时间：2020-04-15 23:25
【摘要】：目的:研究葛根素对MC3T3-E1成骨细胞发育的影响及机制,为临床治疗骨质疏松症及葛根素的开发利用提供一定的理论指导。方法:1.细胞活性测定:不同浓度的(0.1,1,l0μM)葛根素培养成骨细胞24,48和72h后,CCK-8法检测空白对照组和葛根素组的细胞活性。2.细胞分化水平测定:lμM葛根素作用于成骨细胞72h后测定细胞碱性磷酸酶(ALP)活性。3.细胞矿化水平测定:lμM葛根素处理成骨细胞7、14和21d后,茜素红钙结节染色法测定细胞矿化结节面积。4.蛋白表达水平测定:1μM葛根素作用细胞0,48,72h后以及100μM RAP(自噬激动剂)和75μM 3-MA(自噬抑制剂)作用细胞72h后,Western Blotting法测定Beclin1和LC3B蛋白质的表达水平。5.细胞超微结构观察:1μM葛根素和100μM 3-MA作用成骨细胞72h后电镜下观察细胞超微结构并拍摄图片。6.自噬对成骨细胞的影响:使用100μM 3-MA作用MC3T3-E1细胞后,检测成骨细胞增殖、分化和矿化能力的改变。7.葛根素对miR-204表达水平的影响:RT-qPCR法检测葛根素作用后miR-204表达水平。8.miR-204的作用靶点预测:采用TargetScan靶点预测软件分析miR-204与小鼠LC3B基因可能的结合位点。9.miR-204对成骨细胞自噬水平和超微结构的影响:成骨细胞转染miR-204-siRNA后,检测LC3B蛋白质的表达水平并于电镜下观察细胞超微结构。结果:1.葛根素(0.1,1,10μM)可显著促进小鼠MC3T3-E1成骨细胞的增殖,1μμM葛根素为最佳浓度。与空白对照组相比,1μM的葛根素作用72h可明显提高ALP活性,并促进矿化结节的形成。2.1μM浓度葛根素作用于细胞后,与空白对照组比较自噬标志物Be clinl和LC3B的蛋白质表达水平明显升高,其中72h作用效果最好,且作用72h后葛根素组LC3B的蛋白表达水平略高于自噬激动剂组。此外,葛根素组细胞电镜下可明显观察到自噬特有的双层膜结构。3.自噬抑制剂(3-MA)作用细胞72h后,明显抑制成骨细胞增殖和分化,而对矿化结节形成影响不显著。4.1μM葛根素作用细胞72h后,miR-204表达水平显著下调。5.生物信息学分析表明,LC3B mRNA中的miR-204结合位点是位于LC3B 3'UTR的44和50bp之间的广泛保守的元件。6.转染miR-204-siRNA作用细胞后,与空白对照组比较,LC3B的蛋白质表达水平明显上升,并且电镜下细胞出现自噬特有的双层膜结构。结论:(1)葛根素可以促进成骨细胞增殖、分化和矿化。(2)葛根素作用于成骨细胞可以产生自噬现象。(3)葛根素作用成骨细胞产生的自噬可以促进成骨细胞增殖和分化,对矿化影响不明显。(4)下调miR-204表达导致LC3B表达增强可能是葛根素促成骨细胞自噬的分子机制。
【图文】：
实验研究逡逑结果逡逑对ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞增殖能力的影响逡逑１可见，不同浓度的葛根素（０．１，邋１，邋ｌＯ＾Ｍ）分别处理ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞－８检测结果显示，与空白对照组相比，（除０．１和ｌＯ＾Ｍ葛根素作用２４根素作用细胞后，ＯＤ值均显著增高。而ｌｐＭ葛根素作用７２ｈ促增殖ＡＬＰ碱性磷酸酶活性的检测实验中将葛根素药物浓度确定为ｌｕＭ，
３．葛根素对ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞形成矿化结节能力的影响逡逑通过茜素红染色法计算矿化结节面枳，进一步检测葛根素对Ｎ１Ｃ３Ｔ３－Ｅ１细胞矿化的影逡逑响。如图３Ａ－Ｂ所示，与对照组相比，用小Ｍ浓度葛根素分别处理细胞７，邋１４和２１ｄ／Ｔｆ，逡逑矿化结节的形成显著增加。结果表明，葛根素能提高ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞的矿化能力，，促进Ｍ逡逑Ｃ３Ｔ３－Ｅ１细胞的进？？步分化成熟。逡逑灥v醻枺停欤殄澹辏辏剩颍椋颍戾义希悖铮睿簦颍铮戾澹ǎ保埃埃╁澹穑酰邋澹ǎ
本文编号：2629113
【图文】：
实验研究逡逑结果逡逑对ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞增殖能力的影响逡逑１可见，不同浓度的葛根素（０．１，邋１，邋ｌＯ＾Ｍ）分别处理ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞－８检测结果显示，与空白对照组相比，（除０．１和ｌＯ＾Ｍ葛根素作用２４根素作用细胞后，ＯＤ值均显著增高。而ｌｐＭ葛根素作用７２ｈ促增殖ＡＬＰ碱性磷酸酶活性的检测实验中将葛根素药物浓度确定为ｌｕＭ，
３．葛根素对ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞形成矿化结节能力的影响逡逑通过茜素红染色法计算矿化结节面枳，进一步检测葛根素对Ｎ１Ｃ３Ｔ３－Ｅ１细胞矿化的影逡逑响。如图３Ａ－Ｂ所示，与对照组相比，用小Ｍ浓度葛根素分别处理细胞７，邋１４和２１ｄ／Ｔｆ，逡逑矿化结节的形成显著增加。结果表明，葛根素能提高ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞的矿化能力，，促进Ｍ逡逑Ｃ３Ｔ３－Ｅ１细胞的进？？步分化成熟。逡逑灥v醻枺停欤殄澹辏辏剩颍椋颍戾义希悖铮睿簦颍铮戾澹ǎ保埃埃╁澹穑酰邋澹ǎ
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