日本沼虾原肌球蛋白的分离鉴定及致敏性分析

发布时间：2020-04-17 06:12

【摘要】：日本沼虾(Macrobrachium nipponense)又被称为河虾,是我国重要的淡水养殖虾品种之一,其肉质鲜美、营养丰富,颇受消费者的青睐。但是日本沼虾能够引起严重的过敏反应,对过敏患者的生活造成极大的困扰。日本沼虾的消费量在逐年增长,但是相较于其他甲壳类,有关日本沼虾过敏的研究却较少。因此,本研究旨在科学评价日本沼虾致敏性,为进一步深入认知日本沼虾过敏提供依据。本文以日本沼虾原肌球蛋白为研究对象,对其致敏性进行体外和动物实验评价。研究内容主要包括:日本沼虾原肌球蛋白的分离鉴定;日本沼虾原肌球蛋白免疫应答的研究;基于KU812细胞模型及动物模型评价日本沼虾原肌球蛋白的致敏性。本研究的主要方法、结果及结论如下:1.采用硫酸铵盐析以及阴离子交换层析法分离纯化日本沼虾原肌球蛋白,并利用SDS-PAGE和质谱技术进行分析鉴定。结果表明,该方法纯化得到的原肌球蛋白纯度可达90%以上。该方法简单可靠,且提纯效果较好,适用于实验室少量制备。2.以纯化的日本沼虾原肌球蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔,获得抗日本沼虾原肌球蛋白的兔多克隆抗体,并通过间接ELISA法和免疫印迹法检测其效价和特异性。结果显示,制备的兔抗日本沼虾多克隆抗体效价最高可达1:1,638,400,且特异性较强。由此提示,制备的原肌球蛋白具有良好的抗原性。3.利用虾类过敏患者血清与KU812细胞共同孵育,通过检测KU812细胞活化脱颗粒释放的组胺、β-氨基己糖苷酶、钙离子、IL-4、IL-6及TNF-α的含量评价日本沼虾原肌球蛋白的致敏性。研究结果显示,原肌球蛋白组细胞胞内钙离子表达量为79.8%,比空白组钙离子表达量高79.6%,比粗蛋白组高11.4%;原肌球蛋白组细胞β-氨基己糖苷酶释放率为56.88%,与其他两组相比显著升高;原肌球蛋白组细胞上清液中组胺、IL-4、IL-6、TNF-α的含量分别为15.47μg/mL、3.36 ng/mL、793.33 pg/mL、411.53 pg/mL,都显著高于空白对照组和粗蛋白组。由此可见,日本沼虾原肌球蛋白对KU812细胞具有明显的脱颗粒作用和致敏性。4.通过建立Balb/c小鼠致敏模型对日本沼虾原肌球蛋白的致敏性进行评估。结果显示,原肌球蛋白组小鼠产生了明显的过敏症状,且该组小鼠血清中的特异性IgE和IgG1水平均显著高于其他组;原肌球蛋白组小鼠血浆中组胺含量为28.11μg/mL,同样显著高于其他组含量;原肌球蛋白组小鼠血清中的mMCP-1及脾细胞释放的IL-4、IL-5、IL-13、IL-21、IFN-γ水平分别为:470.17 ng/mL、24.26 pg/mL、186.40 pg/mL、597.90 pg/mL、1.46 pg/mL、1863.00 pg/mL,其中mMCP-1、IL-4、IL-5、IL-13的水平均明显高于PBS和CT组,IFN-γ水平则明显低于其他组。综合上述各项指标的检测结果可知,原肌球蛋白具有很强的致敏性。
【图文】：

电泳图,粗蛋白,日本沼虾,蛋白S

用 SPSS 22.0 软件进行单示具有极显著性差异，作定粗蛋白成分本沼虾肌肉中的粗蛋白以示。日本沼虾粗蛋白成分分子质量最大的可超过 1 以上，其中相对分子质量约后，大量的杂蛋白被除去

电泳图,盐析,硫酸铵,硫酸铵盐析

A B图 2.2 硫酸铵分段盐析 SDS-PAGE 电泳图A：20%-50%硫酸铵盐析上清中蛋白质成分。M：Marker；1：20%上清；2：30%上清；3：40%上清；4：50%上清
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R593.1;S917.4

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