人卵巢组织来源环状RNA的鉴定及其在卵巢衰老中的调控作用

发布时间：2020-04-18 19:40

【摘要】：第一部分人卵巢组织环状RNA的测序与鉴定[目的]环状RNA(circRNAs)可通过充当miRNA“海绵”参与多种病理生理过程。然而,人卵巢组织中是否存在circRNA?这些circRNAs在卵巢衰老过程中是否发挥作用,目前尚未可知。本部分研究的目的是筛选鉴定与卵巢衰老相关的circRNAs,并预测其潜在的生物学功能。[方法]采集因妇科良性疾病在我院妇产科行腹腔镜手术治疗的女性患者的卵巢皮质组织,时间自2017年2月至2017年10月。对符合测序要求的女性卵巢组织标本进行circRNA高通量测序,鉴定卵巢组织来源circRNA的表达谱。通过qRT-PCR和Sanger测序的方法在大样本卵巢组织标本中验证卵巢来源circRNA的存在及测序结果的可靠性。分子生物学实验进一步验证卵巢组织来源circRNAs的一般生物学特征。对差异表达circRNAs进行生物信息学分析,预测其潜在的生物学功能,构建circRNA-miRNA-mRNA相互作用网络。[结果]本研究共采集78例卵巢皮质组织,其中,纳入6例卵巢组织标本(年轻组20～30岁和高龄40～50岁各3例)进行circRNA高通量测序。测序结果共检测到48,220个circRNAs,其中194个circRNAs随年龄增加呈现显著上调表达,207个circRNAs呈显著下调表达(倍数变化2,P0.05)。qRT-PCR和Sanger测序验证了这些circRNAs的存在。随机挑选的8个差异表达circRNAs在较大样本卵巢组织标本中(n=44)得到了进一步验证。生物信息学分析表明,这些差异表达circRNAs可能与卵巢衰老相关的代谢过程相关,如调节内分泌途径、氧化还原过程、类固醇激素生物合成和胰岛素分泌途径等信号通路均显着相关(P0.05)。我们进一步验证了卵巢组织来源circRNAs的一般生物学特征,包括反向剪接、耐RNaseR酶消化特性、稳定性和可变剪接特性等。生物信息学预测大多数 circRNAs 携带 miRNAs 结合位点,其中circDDX10-miR-1304660-SIRT3轴可能参与卵巢功能的调节。[结论]女性卵巢组织中有大量circRNAs表达,其中一部分circRNAs随着年龄增高呈现显著上调或者下调,可能在卵巢衰老的发生发展中发挥重要作用。第二部分人卵巢组织来源环状RNA在卵泡液颗粒细胞中的表达及其与辅助生殖临床结局的相关性分析[目的]检测人卵泡液颗粒细胞中circRNAs的表达水平,分析其与女性年龄、BMI、卵巢储备功能及辅助生殖临床结局的相关性。[方法]收集因不孕症来我院生殖医学中心行辅助生殖技术治疗的女性卵泡液标本239例,时间自2017年10月至2018年7月采用Percoll密度梯度离心法分离提取颗粒细胞,室温下存放Oh、6h、12h、24h这4个时间点后,qRT-PCR检测颗粒细胞中circRNAs及其对应mRNA的表达情况。同时检测3个已经验证的差异表达且可能与卵巢功能相关的circRNAs在人卵泡液颗粒细胞中的表达水平,进一步筛选验证后,将该circRNA的表达水平与对应患者的卵巢储备功能及辅助生殖临床结局作相关性分析。[结果]本研究共采集人卵泡液标本239例,分离提取得到颗粒细胞标本210例。在24 h内,颗粒细胞中的circRNAs表达水平无显著改变(P0.05),稳定性较好,而其。对应mRNA迅速降解。在进一步筛选验证的3个circRNAs中发现,circDDX10在人卵泡液颗粒细胞中的表达水平呈现随年龄递增而逐渐下降的趋势,差异有统计学意义(P0.01),而与BMI未见明显统计学差异(P0.05)。进一步分析发现,人卵泡液颗粒细胞中circDDX10的表达水平与AMH(r=0.45,P0.01)及 AFC 均呈正相关(r=0.32,P0.01),但与 FSH 及 E2均未见明显线性相关关系(均为P0.05)。将210例人卵泡液颗粒细胞标本按照circDDX10表达水平的四分位数(Q1、Q2、Q3、Q4)进行亚组分析,结果显示,各组年龄、AMH、AFC及不孕年限有显著差异(均为P0.01);但BMI、FSH及E2均未见显著差异(均为P0.05)。Q3、Q4组在获卵数方面明显高于Q1、Q2组(均为P0.01)。各组在正常受精率方面均未见明显统计学差异(均为P0.05)。在优胚率方面,各组之间差异均具有统计学意义(P0.05或P0.01),其中,Q4组明显高于Q1组(P0.05)。而在βhCG阳性率及临床妊娠率方面,各组之间均未见明显统计学差异(均为P0.05),但总体上与circDDX10的表达水平呈现正相关的趋势。[结论]人卵巢组织来源circRNAs可在人卵泡液颗粒细胞中稳定表达,其中circDDX10的表达水平与卵巢储备功能、获卵数和优胚率密切相关,有望成为一种有价值的预测辅助生殖结局的新指标。第三部分人卵巢组织来源环状RNA参与卵巢衰老的调控及初步机制研究[目的]为了进一步阐明卵巢组织来源circRNA——circDDX10对卵巢功能的影响,初步探讨circDDX10参与卵巢颗粒细胞衰老的作用机制。[方法]分子生物学实验进一步验证卵巢组织来源circRNAs——circDDX10的一般生物学特征。通过构建特异的circDDX10沉默(si-circDDX10组)及过表达载体(over-circDDX10组),转染人颗粒细胞系(COV434),无效干扰序列(Negative Control,NC组)及质粒空载体(Empty Vector,EV组)分别作为对照。qRT-PCR及Westernblot检测各组凋亡相关基因/蛋白BAX、BCL-2、CASPASE-3、CASPASE-9的表达水平,TUNEL法检测各组颗粒细胞凋亡情况。CCK-8试剂盒检测各组颗粒细胞0h、24 h、48 h、72 h、96 h的细胞增殖活性。qRT-PCR法检测各组类固醇激素合成相关基因(CYP11A1、CYP1 7A1、CYP19A1、StAR及HSD1 7B1)的表达水平,试剂盒(化学发光免疫分析法,CLIA)检测各组各组培养液上清中雌激素(Estradiol,E2)及孕激素(Progesterone,P)的表达水平。[结果]circDDX10由DDX10基因7～10号外显子头尾反向剪接而成,主要定位于细胞核中。circDDX10具有circRNA的一般生物学特性,即反向剪接、不含PolyA尾、耐RNase R消化、稳定不易降解等特点。干扰circDDX10可导致颗粒细胞中凋亡相关基因BAX、CASPASE-3及CASPASE-9的表达显著上调(P0.05),但对抑凋亡基因BCL-2的表达无显著影响(P0.05),而过表达circDDX10可显著抑制 CASPASE-3 及 CASPASE-9 的表达(P0.05),但对BAX及BCL-2的表达无显著影响(P0.05)。与转录水平的改变相类似,干扰circDDX10可促进颗粒细胞中凋亡相关蛋白BAX、CASPASE-3及CASPASE-9的表达,而抑制BCL-2蛋白的表达,过表达circDDX10则起相反作用。TUNEL结果进一步验证了上述结果。CCK-8结果示,干扰circDDX10可导致颗粒细胞增殖活性降低,而过表达circDDX10可诱导颗粒细胞增殖活性升高。干扰circDDX10可显著抑制类固醇激素合成相关基因CYP11A1及CYP19A1的表达(P0.05),但对CYP17A1、StAR及HSD1 7B1的表达无明显抑制作用(P0.05);过表达circDDX10可显著促进CYP19A1及HSD17B1的表达(P0.05),但对CYP11A1、CYP1 7A1及StAR的表达无明显改变(P0.05)。各组培养液上清中E2及P的检测结果示,circDDX10干扰组E2浓度显著下调(P0.01),但对P的浓度无明显影响(P0.05);相反地,circDDX10过表达组中,E2浓度显著上调(P0.01),而P的浓度亦明显上调(P0.05)。[结论]沉默circDDX10可促进颗粒细胞凋亡,抑制颗粒细胞增殖,而过表达circDDX10可起到相反作用。沉默circDDX10可抑制类固醇激素合成相关基因的表达,而过表达circDDX10可促进类固醇激素合成。circDDX10可能通过影响颗粒细胞增殖凋亡及类固醇激素合成,参与卵巢颗粒细胞功能的调控。
【图文】：

测序标本挑选：选取质检合格（总ＲＮＡ片段完整，ＲＩＮ２邋０．７，未出现ＲＮＡ逡逑降解，纯度１．８？２．０，浓度ｌＯＯｎｇ／＾ｄ，ＴｏｔａｌＲＮＡ量达到１０w'以上，合格标本电逡逑泳图示例见图１）的６例标本Ｃ低龄２０￣３０岁组３例，高龄４０？５０岁组３例）送逡逑公司测序（上海晶能生物有限公司）。患者平均年龄分别为２６．３３±邋１．２５岁和４５逡逑±０．８２岁，患者的基本信息，包括年龄、体重指数（ＢＭＩ）和基础性激素水平见逡逑表３。逡逑图１．电泳图的Ｃ为标准品，，上样量为５００邋ｎｇ，图片显示为三条清晰的条带逡逑（２８ｓ／１８ｓ／５ｓ）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．邋Ｔｈｅ邋Ｃ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ邋ｉｓ邋ａ邋ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｗｉｔｈ邋ａ邋ｌｏａｄ邋ｏｆ邋５００邋ｎｇ邋ａｎｄ逡逑ｔｈｅ邋ｆｉｇｕｒｅ邋ｓｈｏｗｓ邋ｔｈｒｅｅ邋ｃｌｅａｒ邋ｂａｎｄｓ邋（２８ｓ／１８ｓ／５ｓ）．逡逑表３．纳入本研宄的患者基本信息逡逑Ｔａｂｌｅ邋３．邋Ｂａｓｉｃ邋ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｉｎｃｌｕｄｅｄ邋ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔｓ邋ｉｎ邋ｔｈｉｓ邋ｓｔｕｄｙ．逡逑．逦Ｓｅｒｕｍ邋ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ邋ｈｏｒｍｏｎｅｓ邋ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ逡逑Ｎｏ．邋Ａｇｅ邋ＢＭＩ邋（ｋｇ／ｍ２）逡逑ＡＭＨ邋（ｎｇ／ｍｌ）邋ＦＳＨ邋（ＩＵ／１）邋ＬＨ邋（ＩＵ／１）邋Ｅ２（ｐｇ／ｍｌ）逡逑２５逦２２．３１逦４Ｊ６逦５＾５７逦４Ｊ７逦４５逡逑２逦２６逦２１．７４逦６．６９逦５．５９逦５．７３逦６１逡逑３逦２８逦２０．７０逦７．４４逦３．７６逦

５邋Ｇ数据量）。将测序所得数据与人类基函组数据库进行比对，使用Ｔｏｐｈａｔ软件逡逑分析预测环状ＲＮＡ。以上测序及生物信息学分析：￡作由上海晶能生物科技有限逡逑公司完成。测序分析流程图见下图（图２）。逡逑Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ逡逑去除ｒＲＮＡ逡逑片段化逡逑随机打断片段逡逑随机引物反转录逡逑双链ｃＤＮＡ逡逑末端补平、加Ａ，逡逑连接头逡逑ＰＣＲ扩增逡逑ＲＮＡ－ｓｅｑ邋ｃＤＮＡ文库逡逑Ｈｉｓｅｑ测序仪测序逡逑图２．邋ｃｉｒｃＲＮＡ测序建库流程。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．邋Ｆｌｏｗ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｃｉｒｃＲＮＡ邋ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．逡逑２．５．３测序结果验证逡逑２．５．３．１邋总邋ＲＮＡ邋提取逡逑操作同前。逡逑１８逡逑
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R711.75

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本文编号：2632461