sFRP5在高脂饮食小鼠骨组织改变中的作用及其机制研究

发布时间：2020-04-24 01:16

【摘要】：背景:随着生活水平的提高,全世界肥胖人群逐年增多,其中能量摄入过多是导致肥胖的最主要原因。长期高脂饮食会导致一些脏器的改变,例如肝脏、大脑、心脏等。在骨组织,高脂饮食会引起的骨髓脂肪组织(BMAT)的增多,影响骨的自稳性和骨的再生,近年来到关注。BMAT作为“新”脂肪库出现,占成年人总脂肪量的5%,而BMAT作为一种独特的脂肪库,其重要性已在骨脂相互作用中得到证实。而其中脂肪组织作为内分泌器官所分泌的脂肪因子引起了很大的作用。最近有一些研究发现,脂肪组织所分泌的脂肪因子,在骨组织形成以及代谢过程中有着重要作用,脂肪因子可以调控骨髓间充质干细胞的分化过程,调节其成骨分化及成脂分化的方向来影响骨的形成。脂肪因子家族包括有瘦素、脂联素、分泌型卷曲相关蛋白5(secreted Frizzled-related protein 5,s FRP5)等,其中s FRP5还是Wnt信号通路的抑制剂,一些研究已经发现高脂饮食导致的肥胖小鼠,骨骼,血清中s FRP5表达明显增高。本研究目的在于检测高脂饮食小鼠骨组织中s FRP5的表达与骨组织变化的相关性,s FRP5对骨髓间充质干细胞成脂和成骨分化的调节,以探求BMAT中的s FRP5在高脂饮食引起的骨组织的改变中的作用。同时我们也检测了高脂饮食肥胖小鼠骨内自噬水平的变化,以及骨髓间充质干细胞分化过程中自噬水平的改变。第一部分:高脂饮食对小鼠骨骼结构的影响以及s FRP5的表达目的:构建高脂饮食肥胖小鼠并检测骨组织结构变化与s FRP5相关性方法:选取4周龄健康雄性小鼠40只,其中C57BL"6小鼠20只,ob/ob小鼠20只。分为高脂饮食组及正常饮食组喂养。进行喂养10周,喂养过程中每周测量体重。喂养结束后收取血清检测血糖,高密度脂蛋白,低密度脂蛋白,甘油三脂等生化指标。测量体长,肝重、脂肪重、体重并取材,分离取出一侧股骨固定,进行Micro-CT检测后对股骨脱钙并包埋,制作成骨切片进行Alcian Blue、HE和Masson染色以及免疫组化,进行观察及对比。另一侧骨组织冻于液氮中,择期提取骨组织的RNA,进行PCR。检测s FRP5及相关因子进行对比。结果:高脂饮食诱导的小鼠组在喂养10周后体重及身长远大于对照组(P0.05)。生化指标高脂组远高于对照组(P0.05)。肥胖小鼠模型构建成功。通过Micro CT检测股骨骨量,结果示与高脂组相比于正常喂养组骨量及骨小梁等明显降低(P0.05),ob/ob小鼠高脂喂养后,体重增加更快,骨量下降更明显。HE,Alcian Blue,Masson染色结果显示高脂喂养后骨小梁降低,胶原生成减少,骨髓腔中的脂肪组织增多。PCR及免疫组化结果显示高脂组骨组织和骨髓腔中s FRP5的表达增高,成脂相关因子表达增高。结论:高脂饮食引起小鼠骨量降低,BMAT增加,骨组织中s FRP5的表达增高,ob/ob小鼠变化更为明显。第二部分:检测s FRP5对骨髓间充质干细胞分化的作用及机制探讨目的:分离培养小鼠骨髓间充质干细胞并鉴定,探讨s FRP5对于小鼠骨髓间充质分化的影响及其作用的机制方法:从4周龄雄性小鼠股骨中分离培养骨髓间充质干细胞,观察其细胞形态,体外培养传代后进行流式细胞术检测细胞表面分子标记,体外培养后进行成脂成骨诱导,并采取油红O染色检测脂滴;ALP和茜素红检测成骨情况。将鉴定好的细胞体外继续培养,按照RFP+ODM,s FRP5+ODM,RFP+NM,s FRP5+NM进行分组,处理7d后进行ALP染色,处理14d后进行油红O染色,茜素红染色。染色同日提取四组RNA及蛋白,分别采取PCR,Western blot检测成骨成脂因子以及Wnt信号通路相关表达。结果:体外诱导脂肪细胞形成和高脂饮食小鼠的脂肪组织中,s FRP5的表达均明显增加,s FRP5能促进间充质干细胞的成脂分化。成骨诱导后,BMMSC的ALP染色和茜素红染色均明显增加,s FRP5能抑制ALP染色和茜素红染色。s FRP5能上调成脂转录因子PPARγ和相关脂肪因子的表达,并下调成骨转录因子Runx2和成骨相关因子的表达。成骨诱导能激活BMMSC中Wnt经典信号的转录调节活性,β-catenin蛋白的表达及其Ser675位点磷酸化水平明显升高,s FRP5抑制BMMSC成骨分化中Wnt经典信号的激活,β-catenin蛋白的表达及其Ser675位点磷酸化水平收到抑制。结论:s FRP5能调节BMMSC的分化平衡,促进成脂分化,抑制成骨分化,与Wnt/β-catenin信号通路的调节有关。第三部分:自噬在高脂诱导的肥胖小鼠骨骼的作用探讨目的:探求高脂饮食诱导的肥胖小鼠中骨骼自噬变化的水平以及骨髓间充质干细胞分化过程中自噬的变化。方法:PCR检测高脂肥胖小鼠骨内自噬相关因子Beclin-1和LC3的表达,免疫组化检测骨内Beclin-1表达。培养的骨髓间充质干细胞分为成脂培养基、成骨培养基、普通培养基进行处理,电镜下观察自噬小体。m RFP-e GFP-LC3质粒转染细胞后,激光共聚焦下观察。提取3组蛋白,Westernblot检测三组自噬相关蛋白表达。3MA(自噬抑制剂)处理三组细胞后,油红及茜素红染色观察其成脂和成骨能力的改变。结果:高脂喂养后自噬相关基因的表达发现高脂饮食后骨内Beclin-1和LC3表达明显增加,组化结果显示高脂组骨内Beclin-1表达增加。电镜显示成脂诱导后自噬小体明显增多,成骨诱导的自噬小体也有一定增多。Western-blot显示成脂培养诱导后Beclin-1和LC3II/I的表达比例增加,P62的表达下降。成骨培养诱导后LC3II/I的表达比例增加也有增加。转染m RFP-e GFP-LC3质粒后,成脂诱导后细胞中绿色和红色亮点数量均明显增加,成骨诱导后亮点数量增加相对较少。3MA作用后油红染色及茜素红染色减少。结论:高脂饮食诱导小鼠骨组织内自噬水平增加。骨髓间充质干细胞成脂和成骨分化中自噬水平增加,成脂分化增加尤为明显。抑制自噬能抑制骨髓间充质干细胞的成骨和成脂分化。
【图文】：

高脂,后体,小鼠,体重变化

图 1.1 四组小鼠高脂及普通饮食喂养 9 周后体重的变化。A：大体图(a 为 C57BL/6J 高脂组，b 为 C57BL/6J 喂养组，c ob/ob 高脂组，，d ob/ob 正常喂养组)。 B：体重变化Fig1.1 Four groups mouse were fed for 9 weeks.A.Appearance (a C57BL/6J mouse for HFD, bC57BL/6J mouse for NCD, c ob/ob mouse for HFD, d ob/ob mouse for NCD). B. The change ofweights. *p<0.05, **p<0.01, **p<0.001

骨组织,化学染色,脱钙,包埋

图 1.2 骨组织 MicroCT 扫描及分析Figure 1.2 MicroCT scanning and analysis of bone. *p <0.052.4 四组骨组织的骨组织化学染色结果骨组织固定后，经脱钙包埋切片处理后，分别进行 HE 染色、Alcian Blue 染
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R589.2

【参考文献】