AMPK通路介导自噬调控高糖环境下破骨细胞形成与功能机制研究

发布时间：2020-04-24 19:35

【摘要】：目的:物质生活的丰富与人类寿命的延长,使得慢性疾病对健康的威胁愈发占据突出地位。其中,糖尿病是一种典型代表性疾病。糖尿病性骨质疏松是糖尿病的重要并发症之一,骨质疏松病的特点为骨吸收增多,同时骨形成减少,造成骨量减少和骨组织微结构改变导致骨质脆性增加和骨折风险增高。高糖血症是1型和2型糖尿病的共同特点,其可能是增加骨折风险的因素。普遍观点认为葡萄糖能促进破骨细胞分化并增强其功能,但是,一部分学者的研究表明高糖会对破骨细胞起到抑制作用。因此,在高糖对于破骨细胞的影响问题上仍然存在争议。自噬是一种主要负责消除受损蛋白和细胞器的过程,现在被广泛认为是一种抗衰老程序。并且,自噬也被认为是一种维持细胞稳态的应激反应机制。自噬在破骨细胞中也起着重要作用。自噬蛋白Beclin-1通过诱导ROS和NFATc1基因的表达来作用于RANKL相关破骨细胞分化,同时,敲除Atg5,Atg7和LC3的破骨细胞出现细胞特异性蛋白CTSK的分泌和特异性皱褶结构形成的减弱。AMPK通路是一条主要的代谢调控通路,其激活与否与葡萄糖的多寡相关。同时,该通路可以通过调控下游mTORC1与ULK1元件对细胞自噬发挥作用。因此,本课题主要通过研究高糖环境对破骨分化和功能的影响,以及自噬在高糖环境下破骨细胞分化与功能变化中的作用,同时观察相关信号通路的变化情况,探讨高糖环境影响破骨细胞分化和功能方面的分子机制。研究方法:使用CCK8试剂检测不同浓度(5.5,10.5,15.5,20.5,25.5,和30.5mM/L)的葡萄糖以及不同时间点(第1至第6天)对RAW264.7细胞活力的影响;使用Western Blotting法检测不同糖浓度对诱导至第四天的破骨细胞组织蛋白酶K(Cathepsin K,CTSK)表达水平;使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒检测不同糖浓度对诱导至第四天的破骨细胞个数的影响;使用羟基磷灰石基质骨吸收孔板检测不同糖浓度对诱导至第四天的破骨细胞吸收能力的影响。使用Western Blotting法检测低糖、高糖以及相应浓度添加AMPK通路抑制剂Compound C下诱导至第四天的破骨细胞AMPK通路相关蛋白p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、p-ULK1和ULK1表达情况,同时检测此条件下自噬相关蛋白LC3I/LC3II和P62表达情况;使用Western Blotting法检测低糖(5.5mM/L)和高糖(30.5mM/L)浓度下诱导至第四天的破骨细胞自噬相关蛋白Beclin-1、LC3I/LC3II和P62的表达情况;使用透射电子显微镜观察低糖和高糖浓度下诱导至第四天的破骨细胞自噬体数量情况;使用免疫荧光染色观察低糖和高糖浓度下诱导至第四天的破骨细胞内源性点簇状LC3聚集情况;使用Western Blotting法检测自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)和巴佛罗霉素A1(Bafilomycin A1,BafA1)以及自噬激动剂雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)作用下诱导至第四天的破骨细胞自噬相关蛋白LC3I/LC3II和P62以及破骨功能蛋白CTSK表达情况;同时使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒检测此条件下对诱导至第四天的破骨细胞个数的影响。结果:从5.5mM/L至30.5mM/L的6组不同糖浓度培养基对RAW264.7细胞活力无显著影响,但是发现随着糖浓度的增加,破骨细胞功能蛋白CTSK表达逐渐下降,破骨细胞形成个数与骨吸收面积逐渐减少;低糖(5.5mM/L)和高糖(30.5mM/L)诱导培养基诱导破骨细胞形成4天后,与低糖环境相比,高糖条件下破骨细胞AMPK/mTOR/ULK1信号通路表达水平受抑制,同时使用AMPK通路抑制剂Compound C可以抑制低糖或高糖环境下自噬蛋白LC3II的表达,增加P62的表达;低糖及高糖环境诱导破骨细胞形成4天后发现低糖环境下自噬相关蛋白Beclin-1和LC3II表达增强,P62表达减弱,透射电子显微镜与免疫荧光染色检测发现低糖环境下破骨细胞自噬体数量高于高糖环境下的数量;利用自噬抑制剂3-MA和bafA1以及自噬激动剂Rapa作用于破骨细胞形成过程,发现与对照组相比,3-MA和bafA1可以抑制CTSK表达与破骨细胞形成数量,而Rapa可以促进CTSK的表达与破骨细胞形成数量。结论:1、糖浓度的变化不影响RAW264.7细胞活力,但是高糖会抑制破骨细胞形成与功能。2、AMPK/mTOR/ULK1信号通路在高糖环境下被抑制,同时该通路参与调控破骨细胞自噬的过程。3、高糖环境会抑制破骨细胞形成过程中的自噬水平,进而减弱破骨细胞形成与功能。
【图文】：

糖浓度,细胞活力

2.2.8 统计学分析获取的数据由软件 SPSS19.0 进行统计分析。组间比较使用单因素方差分析，方差一致性检验用 Levene 检验方法，组间比较使用 SNK 方法。p≤0.05 认为差异具有统计学意义，p≤0.01 认为统计学差异非常显著，其余则无统计学意义。3 结果3.1 不同糖浓度对 RAW264.7 细胞活力的影响为了明确糖浓度的变化对破骨前体细胞的影响，我们通过调整培养基使最终糖浓度为 5.5、10.5、15.5、20.5、25.5 和 30.5mM/L 后，培养 RAW264.7 细胞 6 天，并每天在固定时间随机抽取一块 96 孔板检测细胞活力(图 3.1)。结果发现糖浓度在6 天时间内对 RAW264.7 细胞活力无显著影响。

糖浓度,第四,破骨细胞,破骨细胞形成

中国医科大学硕士学位论文因素方差分析和 LSD 法，两组间比较采用 t 检验；NS:各组间比较差异无统计学意义。3.2 不同糖浓度对破骨细胞功能蛋白表达的影响为了探究糖浓度的变化对 RAW264.7 细胞破骨形成的影响，我们通过调整培养基使最终糖浓度为 5.5、10.5、15.5、20.5、25.5 和 30.5mM/L 后，诱导 RAW264.7细胞向破骨细胞形成，并在第四天结束诱导。通过蛋白免疫印迹法检测发现，随着糖浓度增加，破骨细胞功能蛋白 CTSK 表达水平逐渐减弱（图 3.2）。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R580

【参考文献】