Apert综合征颅骨畸形的致病机制及分子治疗研究

发布时间：2020-04-30 17:22

【摘要】：颅骨由颅盖骨、颅面骨和颅底组成。它们是通过不同的发育模式形成的。颅盖骨是通过膜内成骨形成的,在膜内成骨过程中,位于颅缝的间充质前体细胞直接分化为成骨细胞,成骨细胞分泌骨基质成骨,成骨细胞转变为骨细胞,颅骨得以生长。颅底骨是通过软骨内成骨形成的,颅底软骨连接的骨化使得颅底生长和扩张。Apert综合征(AS)是以颅缝早闭(Craniosynostosis)为特征的一种遗传综合征。其表现的主要特征是颅缝早闭,颅底异常,面部中部发育不全,手足并指(趾)等。另外,AS患者颅内压升高,智力低下。AS主要由成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)的相邻氨基酸Ser252Trp(S252W)或Pro253Arg(P253R)的两种突变引起。对Apert患者和小鼠模型的研究表明,其颅缝、颅底和大脑均出现发育异常,它们可能参与了Apert综合征颅骨畸形形成。在AS患者、模拟AS的小鼠模型中最常见的就是冠状缝过早闭合,目前的大多数人认为颅缝早闭是导致颅骨畸形的主要原因。据报道,AS患者的颅底软骨连接发育异常,包括蝶筛骨软骨连接和蝶枕软骨连接过早融合。全身表达或软骨细胞特异表达FGFR2-Pro253Arg突变的小鼠也表现出颅底软骨连接提前融合、颅底变短等表型。软骨发育异常可能在AS患者或小鼠模型的颅骨畸形形成中发挥重要作用。除颅骨发育不良外,AS患者还表现出大脑畸形和智力迟钝等神经系统异常,目前AS患者脑形态异常的原因尚不清楚。人们通常认为AS中的脑畸形是颅缝早闭的结果。然而,有研究者发现,在AS小鼠的颅骨颅缝闭合之前,大脑发育异常已经发生,因此他们认为大脑畸形在Apert中是原发性的,而不是继发于颅骨异常。但是,AS大脑畸形是原发还是继发作用造成的尚需进一步明确。迄今为止,颅骨畸形的发病机制仍不完全清楚。进一步了解颅缝、颅底及大脑在颅骨畸形形成中的作用对AS的治疗策略的制定,以及新疗法的研发都很重要。过去的研究通常用全身表达突变FGFR2的Apert小鼠进行的,不能清晰地解析突变FGFR2在颅盖骨(颅缝)、大脑和颅底异常发育中的直接作用。长期以来,围绕Apert综合征的治疗措施主要是手术矫正治疗及并发症处理等。手术矫正方法包括开放性颅骨重建,牵引和微创技术,如局部颅骨切除术,枕骨瓣松解以及颅盖骨重塑等。手术的目标主要是改善颅骨形态,延迟颅缝闭合,缓解颅内高压。但是,由于进行性头颅发育不良,仅做一次手术往往难以达到效果,往往需要分期进行数次手术,容易引起其它并发症,如脑脊液泄漏等,增加患者痛苦及家庭负担。上述表明仅仅手术治疗Apert综合征难以达到较理想的治疗效果。多年来,针对Apert的治疗策略方面的研究相对较少,导致缺乏有效缓解Apert颅骨畸形的治疗药物。近来,分子治疗展现出强大的应用前景,人们越来越关注通过分子调控手段来治疗颅缝早闭。比如,FGFR酪氨酸激酶抑制剂(PDF303074)被证明可部分缓解FGFR2突变导致的Crouzon综合征的冠状缝早闭症状。Wang等发现在Beare-Stevenson综合征p38 MAPK途径异常激活,而用p38激酶抑制剂处理后抑制了颅缝过早闭合。Apert小鼠小梁骨形成增加,进一步用Wnt/β-catenin抑制剂处理后部分缓解了这一进程。在颅缝早闭的小鼠模型中,丝裂原活化蛋白(MAP)激酶1和2(ERK1/2)抑制剂U0126在Apert小鼠中也有部分抑制颅缝早闭的作用。这些研究表明用分子治疗手段来治疗颅缝早闭是可行的。Apert中的FGFR2增强突变导致多个下游信号传导失调,包括ERK1/2,P38,PI-3K和PLCγ途径等。尽管用抑制剂对单个下游信号分子或互作的信号进行抑制(例如抑制ERK1/2)可以减轻Apert异常的颅缝闭合表型,但是由于其它异常信号通路的参与,往往只能获得部分缓解效果。此外,这些抑制剂特异性不高,往往带来严重的副作用,抑制这些信号通路可能带来潜在的风险。靶向突变FGFR2分子的生物治疗与手术治疗相结合,有望通过药物缓解症状,减少手术次数及并发症风险,减轻病人痛苦及家庭负担。为了阐明颅盖(颅缝)、颅底及大脑在AS颅骨形态异常发病机制中的作用,本研究通过将FGFR2+/P253R-neo小鼠与Col2a1-Cre、骨钙素驱动的Cre(OC-Cre)小鼠和Nestin-Cre小鼠繁殖,建立软骨细胞、成骨细胞和中枢神经系统祖细胞(CNS)中特异表达突变型FGFR2的小鼠。然后利用欧几里德距离矩阵分析(EDMA)技术,通过显微CT和核磁共振定量分析这些突变小鼠的颅骨和大脑形态。从治疗方面考虑,我们筛选到一个小干扰RNA(SiRNA)可以特异地靶向Fgfr2-P253R等位基因,该siRNA可通过减轻Apert小鼠原代成骨细胞的异常分化和基质矿化。另外,本研究筛选到可高效递送治疗表达于颅骨组织及细胞的9型AAV病毒。AAV9运载的Fgfr2-shRNA(AAV9-Fgfr2-shRNA)在小鼠颅骨局部表达可以缓解Apert冠状缝提前闭合状态,也可缓解颅骨异常降低的颅骨骨量。本研究表明基于RNAi的分子治疗方法,可以结合其它方法(包括手术治疗)治疗AS乃至其它骨骼遗传疾病。研究方法:第一部分Apert综合征头颅畸形是由颅盖骨、颅底和大脑发育异常的综合作用导致的1.建立Apert小鼠,软骨细胞特异表达FGFR2突变的Col2a1-253,成骨细胞特异表达FGFR2突变OC-253,以及中枢神经祖细胞特异表达FGFR2突变的Nestin-253小鼠模型,测量小鼠的体重和体长等指标,利用小动物X光机照片、小动物Micro-CT观察小鼠大体表型和骨骼表型。2.用小动物X光机、小动物Micro-CT、病理组织染色等研究各突变小鼠颅骨大体表型,颅缝闭合状态,颅底骨形态及软骨连接融合情况。用核磁共振分析Nestin-253小鼠的大脑形态。3.定义一系列颅骨形态特异标志点,取各突变小鼠颅骨上标志点的三维坐标值,用欧氏距离矩阵分析(EDMA)方法计算标志点之间的距离值,并分析与野生对照小鼠有统计差异的距离,获得突变小鼠颅骨形态发生变化的部位,比较各突变小鼠之间的颅骨形态差异。第二部分Apert综合征头颅畸形的分子治疗探索1.根据Apert小鼠(FGFR2~(+/P253R))突变序列设计一系列与之互补的siRNA,建立Apert小鼠模型,分离其颅骨原代细胞,用siRNA处理该细胞并用定量PCR、WB等检测突变及总Fgfr2的表达变化,评价各siRNA对突变Fgfr2的干扰效率。2.筛选得到的siRNA在颅骨细胞中进一步验证其干扰效果,siRNA处理细胞后用定量PCR、MTT、茜素红染色、ALP染色等检测细胞增生、分化、矿化。用WB检测FGF/FGFR下游信号分子表达变化。3.用siRNA对体外培养的Apert及WT小鼠颅盖骨进行处理,培养7天后用X光、Micro-CT、病理切片等研究颅缝闭合情况,评价颅骨的质量。4.用含荧光报告基因GFP的质粒的病毒AAV2-GFP、AAV5-GFP、AAV-DJ-GFP、AAV9-GFP,局部注射小鼠颅骨,注射后5d和30d检测颅骨部位荧光表达情况,筛选能较高效率感染颅骨细胞的AAV亚型。5.用筛选到的AAV亚型病毒包装Fgfr2-shRNA,活体局部注射Apert及WT小鼠颅骨,评价小鼠颅缝闭合情况及颅骨质量。研究结果:第一部分Apert综合征头颅畸形是由颅盖骨、颅底和大脑发育异常的综合作用导致1.建立了软骨细胞特异表达FGFR2突变的Col2a1-253,成骨细胞特异表达FGFR2突变OC-253,以及中枢神经祖细胞特异表达FGFR2突变的Nestin-253小鼠模型,Col2a1-253,OC-253以及Nestin-253小鼠的体重和体长与WT小鼠比较没有明显变化。用小动物X光机照片、小动物Micro-CT检测表明突变小鼠的大体表型也无明显变化。2.X光机、Micro-CT、病理组织染色等研究表明Col2a1-253小鼠的颅骨出现了Apert综合征类似的颅骨畸形,颅骨长度缩短、左右宽度和上下高度变化不显著,部分小鼠鼻骨扭曲,颅底软骨连接融合提前、颅底变短。CT及HE染色表明Col2a1-253小鼠冠状缝闭合程度增加。OC-253小鼠8周龄时面部鼻骨部位轻微缩短,颅骨其它部位变化不显著。8周的Nestin-253小鼠的大脑后部的高度增加,颅骨后部高度也相应增加,其它部位变化不显著。3.用EDMA方法分析突变与野生对照小鼠颅骨形态差异,发现Col2a1-253小鼠的颅骨出现了Apert综合征类似的颅骨畸形,颅骨前后轴长度缩短、左右宽度和上下高度满意明显变化,颅底软骨连接融合提前、颅底变短。OC-253小鼠8周龄时面部鼻骨部位缩短,颅骨其它部位变化不显著。8周的Nestin-253小鼠的大脑后部的高度增加,颅骨后部高度也增加。第二部分Apert综合征头颅畸形的分子治疗探索1.按照Apert小鼠(FGFR2~(+/P253R))突变序列设计了11个与之互补的siRNA(S1-S11),用siRNA处理Apert小鼠颅骨原代细胞后并用定量PCR、WB等检测发现S2对突变Fgfr2 mRNA的干扰效率较高,对正常Fgfr2 mRNA影响最小,筛选到S2是最好特异地靶向突变Fgfr2的siRNA。2.S2处理颅骨细胞后,定量PCR发现突变的Fgfr2 mRNA表达明显降低、Apert成骨细胞分化标记分子Collagen 1,Runx2等的表达异常得到缓解。MTT检测发现细胞增生变化不显著。定量PCR、茜素红染色、ALP染色等检测发现Apert细胞分化、矿化均有明显降低。用WB检测发现Apert细胞异常增强的p-ERK1/2、p-P38表达有效降低。3.S2处理体外培养的Apert及WT小鼠颅盖骨后,发现X光、Micro-CT、病理切片及HE染色等发现Apert颅盖骨冠状缝闭合程度有效缓解,颅盖骨的质量有效改善。4.荧光检测筛选AAV2-GFP、AAV5-GFP、AAV-DJ-GFP、AAV9-GFP病毒,发现AAV9能较高效率感染颅骨细胞。5.AAV9-Fgfr2-shRNA病毒活体局部注射Apert及WT小鼠颅骨,发现Apert颅骨成骨细胞分化标记分子Collagen 1,Runx2等表达得到有效缓解,冠状缝闭合程度有效缓解,颅盖骨的质量也得到有效改善。结论:一.软骨特异增强FGFR2突变小鼠、成骨细胞特异增强FGFR2突变小鼠以及中枢神经系统祖细胞特异增强FGFR2突变小鼠均表现出Apert综合征小鼠头颅的部分发育异常表型,表明软骨、成骨、大脑均是Apert头颅畸形的原发部位,Apert头颅畸形是由颅盖骨、颅底和大脑发育异常的综合作用导致的。二.筛选到9型腺相关病毒(AAV9)能够高效的感染颅骨组织,可作为运送外源基因在骨组织表达的载体。三.S2及Fgfr2-shRNA处理能在体外细胞、体外培养的颅盖骨、活体小鼠中有效干扰突变Fgfr2的表达,并缓解细胞的分化、基质矿化、颅缝闭合状态以及颅骨质量。
【图文】：

小鼠,颅骨,寿命表,独立样本

析被用来检测多组样本间的差异，独立样本 T13.0 软件对数据进行处理。所有数值以均值加减计学差异。P253R 在小鼠软骨细胞中的特异表达导致 Apert 道中，用全身表达的 Cre 小鼠 EIIa-Cre 与 FGFR鼠（即 EIIa-FGFR2+/P253R，简称 EIIa-253）比野生的颅骨尺寸更短、颅骨左右轴宽度增加、上下高型小鼠相比，Col2a1-253 小鼠的寿命表现正常， 1-1），，身长、尾长也无异常（图 1-2）。对其股骨（图 1-3）。

身长,小鼠,胫骨,股骨

图 1-2 Col2a1-253 及 WT 小鼠身长Figure 1-2. The tail lengths of Col2a1-253 and WT mice图 1-3 Col2a1-253 及对照 WT 小鼠股骨胫骨长度(A) 胫骨股骨；(B) 长度统计e 1-3. The lengths of tibia and femur of Col2a1-253 and W
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R596

【相似文献】