基于尿酸环境下HK-2细胞及小鼠模型肾脏组织中锌α2糖蛋白表达变化的研究

发布时间：2020-05-03 16:56

【摘要】：目的:以高尿酸血症小鼠模型为基础,探讨在高尿酸环境下小鼠肾脏中锌α2糖蛋白(zinc alpha 2 glycoprotein,ZAG)的变化,另外通过构建尿酸细胞模型,观察在尿酸环境下HK-2细胞中ZAG蛋白的变化,为高尿酸血症相关代谢性疾病的研究提供新思路。方法:1)将60只SPF级昆明种小鼠随机分为模型组和空白对照组,97%氧嗪酸钾盐按0.5g/(kg·d)腹腔注射,尿酸酶抑制法建立高尿酸血症小鼠模型,造模7d及14d后,尾静脉采血检测血清尿酸(SUA)水平确定模型建立成功及检测小鼠血清生化指标,利用Western Blotting及实时荧光定量PCR技术检测ZAG mRNA及ZAG表达;2)以含10%胎牛血清的1640为培养基,在37℃培养箱(5%CO_2)内复苏并传代HK-2细胞株。实验主要分为以下几个部分:(1)探讨人肾小管上皮细胞在同一浓度尿酸刺激下锌-ɑ2-糖蛋白(ZAG)的动态表达变化:实验分为空白对照组、不同浓度尿酸模型组,分别为10mg/dl、21mg/dl、26mg/dl。分别于加入干预因素后24h、48h、72h,用Western Blotting法检测锌-ɑ2-糖蛋白(ZAG)表达变化。结果:(1)在7天时间节点上,空白组ZAG低于模型组ZAG蛋白,差异有显著性统计学意义(P0.05)。14天模型组空白组ZAG灰度高于模型组ZAG蛋白灰度。且7天及14天小鼠肾脏组织ZAG mRNA高于空白组,差异有极显著性统计学意义(P0.001)。表明肾脏分泌ZAG,尿酸可以引起ZAG蛋白的改变。(2)在不同尿酸0.1mg/ml、0.21mg/ml、0.26mg/ml诱导24h、48h、72h,用Western Blotting法ZAG浓度与空白组相比灰度均无变化。结论:1)通过HUA模型小鼠与空白小鼠ZAG条带灰度值对比,发现尿酸小鼠模型肾脏较空白组相比可影响ZAG变化,RT-PCR结果也表明高尿酸肾脏ZAG mRNA水平高于空白小鼠ZAG mRNA,表明肾脏细胞分泌ZAG。同时在7天模型小鼠中ZAG表达上高且ZAG mRNA表达上升,且脂代谢代谢紊乱,尤以甘油三酯下降明显,表明尿酸可能通过影响甘油三酯的代谢引起ZAG蛋白的变化。而14天模型组HUA模型小鼠与空白小鼠ZAG条带灰度值对比,发现尿酸小鼠模型肾脏的ZAG是降下的,但ZAG mRNA则是上升趋势,另外考虑尿酸同时有抗氧化和促氧化作用,通过上述文献整理,促氧化可导致炎症因子的产生,故在7天与14天蛋白表达呈现出相反的。2)另外细胞实验显示不同浓度尿酸干预不同时间下,HK-2细胞中ZAG均未有变化,由于细胞不同于动物,且诱导时间有限,故ZAG表达水平并没有变化。3)尿酸可能是通过其他途径使得锌-α2-糖蛋白(ZAG)发生改变。
【图文】：

β-actin 蛋白 （~43KD）注：a.空白组；bc 模型组 β-actin 蛋白为内参图 2-1 7 天及 14 天 ZAG 蛋白在空白组与模型组肾脏中的表达表达图Figure 2-1:7 days and 14 days of ZAG protein expression in the kidneys of the blank group and thegroup2.4 荧光定量 PCR 法验证引物采用实时荧光定量 PCR 法检测小鼠 ZAG m RNA 的表达情况，根据各个样的溶解曲线，小鼠 ZAG 的溶解曲线和内参溶解曲线，无杂峰，引物与模板特异良好，无非特异性扩增产物。HUA 组的峰可与对照组的峰分开，说明 PCR 反应适，扩增目标特异性良好。ZAG 溶解曲线约在（83±0.5）℃，呈现单峰；内参线约在（87±0.5）℃，呈现单峰。取 5μl PCR 扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳验证验证结果可见 150bp 和 100bp 左右有明显单一条带。ZAG

图 2-3 ZAG 蛋白与内参 GAPDH 的凝胶图Figure 2-3 ZAG gel protein and reference GAPDHNA 表达情况比较鼠肾脏组织与空白组 ZAGmRNA 表达水平比较差组 ZAGmRNA 高于空白组。（表 2-5）型组与空白组肾脏组织 ZAGmRNA 表达水平比较（n=1 of the expression level of ZAGmRNAin the renal tissue of tblank group（n=10,x±s）分组 例数（只） ZAGmRNA空白组 10 1.00±0.00模型组 10 1.20±0.22T 值 -8.727P 值 <0.05
【学位授予单位】：右江民族医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R589.7

【参考文献】

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本文编号：2647835