炎症因子TNF-α可影响小鼠MC3T3-E1细胞系的N-cadherin表达及其体外造血支持能力

发布时间：2020-05-04 05:31

【摘要】：目的系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者可以出现血液生成异常,但目前其机理尚不清楚。造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)的分化和自我更新等受骨髓造血微环境调节。而骨髓造血微环境中一些细胞成分,可以通过其表面粘附分子如N-cadherin等与HSCs的相互作用,从而参与调节血液生成。SLE患者体内常有多种炎症因子如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α等异常增高,而这些异常水平的炎症因子除了作用于HSCs外,还可以影响骨髓微环境中的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)、成骨细胞(osteoblast,OB)等细胞成分,通过对这些造血调节细胞来间接干扰正常的血液生成。本研究拟在体外模拟炎症因子TNF-α作用于小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1和BMMSCs,探索其对这两种细胞N-cadherin表达水平的影响及可能机制;并初步探索经TNF-α预处理的MC3T3-E1细胞,对纯化的小鼠Sca-1细胞体外扩增的支持作用。期望通过上述研究,初步揭示SLE患者血液生成障碍发生的可能机制。方法1、首先,用不同浓度(10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml)的TNF-α处理MC3T3-E1细胞3天,Western blot法检测其表面粘附分子N-cadherin的表达,筛选出合适的TNF-α浓度以进行后续实验。然后,用选定浓度的TNF-α分别处理小鼠MC3T3-E1细胞和BMMSCs不同时间,并在TNF-α处理MC3T3-E1细胞3天后,换成不含TNF-α的培养液继续培养不同时间,采用Western blot法检测N-cadherin、p-Erk1/2及p-Akt的表达。2、用CCK8法检测经不同浓度(0~80μM)的Erk抑制剂FR180204处理MC3T3-E1细胞不同时间(1天、2天、3天)后细胞的增殖抑制情况,筛选出合适的抑制剂浓度。用选定浓度的抑制剂处理MC3T3-E1细胞,采用Western blot法检测N-cadherin和p-Erk1/2的表达。3、分离小鼠股骨和胫骨并收集骨髓,磁珠阳性分选富集小鼠Sca-1~+的骨髓细胞,用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测所分离Sca-1细胞的阳性比例。4、先用造血干细胞体外扩增专用培养液Stemspan SFEM体外培养MC3T3-E1细胞,分别观察和检测不同时间点的细胞形态和N-cadherin表达情况,并与在含有10%FBS的α-MEM培养液条件下生长的MC3T3-E1细胞的结果进行比较。然后,用含TNF-α的Stemspan SFEM培养液体外培养MC3T3-E1细胞,3天后更换成不含TNF-α的Stemspan SFEM培养液继续培养不同时间点,Western blot法检测细胞N-cadherin的表达。5、将TNF-α预处理的MC3T3-E1细胞作为饲养层,在造血支持因子SCF、TPO及Flt3-Ligand条件下,体外扩增小鼠Sca-1~+骨髓细胞一周,随后进行集落形成单位(colony-forming units,CFU)检测。结果1、MC3T3-E1细胞经TNF-α处理后,其细胞表面N-cadherin的表达水平下降,并且在一定的浓度范围内随TNF-α浓度的提高而更加显著。根据实验结果,选择20 ng/ml的浓度应用于后续实验。2、20 ng/ml浓度的TNF-α处理MC3T3-E1细胞后,N-cadherin的表达水平在短时间内无明显变化,在培养1天和2天后明显下调;而在去除TNF-α后继续体外培养7天后,MC3T3-E1细胞的N-cadherin表达上升至高于基础水平。在20ng/ml浓度的TNF-α作用下,MC3T3-E1细胞的p-Erk1/2表达水平在1天内均保持高于基础水平;在去除TNF-α作用后,与N-cadherin相反,p-Erk1/2表达在继续培养7天后下降至低于基础水平。3、TNF-α处理小鼠BMMSCs后,短时间(30min和3h)内,N-cadherin和p-Erk1/2的表达水平升高;处理3天后,N-cadherin、p-Erk1/2的表达均逐渐降至基础水平之下。在去除TNF-α后继续培养的过程中,BMMSCs的N-cadherin表达可上升至高于基础水平,p-Erk1/2的表达则继续下降。与p-Erk1/2不同,BMMSCs的p-Akt表达水平在TNF-α处理的整个过程中均无明显变化。4、根据Erk抑制剂FR180204对MC3T3-E1细胞的增殖抑制作用情况,选定7.5μM和10μM两个浓度进行后续实验。与对照组相比,经7.5μM和10μM两种浓度Erk抑制剂处理1天后,MC3T3-E1细胞的p-Erk1/2表达水平均受到明显抑制。在用抑制剂处理的整个过程中,N-cadherin的表达水平均明显高于对照组。5、小鼠骨髓细胞经Sca-1抗体的免疫磁珠阳性分选富集后,流式细胞术检测Sca-1阳性细胞的比例均在90%以上。6、MC3T3-E1细胞用Stemspan SFEM培养液培养后,细胞形态与在含有10%FBS的α-MEM条件下培养的细胞无明显区别,并且N-cadherin的表达水平也无明显差异。不同浓度(10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml)的TNF-α处理3天后,N-cadherin表达明显低于基础水平。用20 ng/ml浓度的TNF-α处理3后,在去除TNF-α继续培养的一周内,细胞的N-cadherin表达均保持在高于基础水平。换用Stemspan SFEM培养液后,TNF-α对MC3T3-E1细胞N-cadherin表达的影响类似于其在含有10%FBSα-MEM条件下培养的结果。7、以TNF-α预处理的MC3T3-E1细胞作为饲养层,在造血支持因子SCF、TPO及Flt3-Ligand条件下,体外扩增小鼠纯化的Sca-1~+骨髓细胞后,其总CFU数目低于对照组,CFU-pre-B数目较对照组明显升高,BFU-E及CFU-GM数目较对照组显著降低。结论炎症因子TNF-α在作用于小鼠前成骨细胞MC3T3-E1和BMMSCs后,可影响细胞的N-cadherin表达水平和Erk1/2的磷酸化。TNF-α对N-cadherin表达水平的影响可能与Erk1/2通路有关。经TNF-α预处理后N-cadherin高表达的MC3T3-E1细胞在与小鼠Sca-1~+骨髓造血细胞相互作用过程中,对骨髓造血细胞的分化和增殖均可以产生影响。我们的研究提示,SLE骨髓微环境中造血支持相关细胞粘附分子N-cadherin的异常,可能是骨髓血液生成异常的机制之一。
【图文】：

表达水平,粘附分子,表面,细胞

第三章实验结果3.1 TNF-α浓度的筛选用含有 10 % FBS 的α-MEM 培养液配制终浓度分别为 10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml 的 TNF-α溶液，处理准备好的 MC3T3-E1 细胞，细胞密度为 2.5×104个/ ml。每天更换新的含有相应终浓度 TNF-α的培养液，培养 3 天后，收集细胞，Western blot 法检测粘附分子 N-cadherin 表达水平的变化。实验结果显示，MC3T3-E1 细胞能够表达粘附分子 N-cadherin。与对照组相比，MC3T3-E1 细胞分别经终浓度为 10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml 的 TNF-α处理 3 天后，其粘附分子 N-cadherin 的表达水平均下降，并且在一定浓度范围内随着 TNF-α浓度的增加而更加明显（图 3.1，F=115.0，P<0.05，n=3）。

表达水平,细胞,炎症因子,粘附分子

炎症因子 TNF-α可影响小鼠 MC3T3-E1 细胞系的 N-cadherin 表达及其体外造血支持能力3.2 实验细胞经 TNF-α处理后 N-cadherin、p-Erk1/2 以及 p-Akt 的表达3.2.1 MC3T3-E1 经 TNF-α处理后其粘附分子 N-cadherin 的表达为了了解 TNF-α对 N-cadherin 表达的下调作用在去除 TNF-α后是否依然存在，我们用终浓度为 20 ng/ml 的 TNF-α处理 MC3T3-E1 细胞。在用 TNF-α连续处理 3 天后，将含有 TNF-α的培养液去除，换成含有 10 % FBS 的α-MEM 培养液继续培养 1 ~ 4 天。Western blot 结果表明，，与上述实验结果一致，MC3T3-E1 细胞经 TNF-α处理 3 天后，其 N-cadherin 的表达水平较对照组明显下降。然而，在去除 TNF-α后继续培养的过程中，从去除后 2 天开始，随着培养时间的延长，N-cadherin 的表达逐渐恢复至高于基础水平（图 3.2，F=620.1，P<0.01，n=3）。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R593.241

【参考文献】