缺氧通过上调fascin1表达促进类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞迁移和侵袭的分子机制

发布时间：2020-05-05 10:38

【摘要】：目的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜增生、血管翳形成和炎性细胞浸润为主要病理特征的系统性自身免疫病,最终可造成患者关节的破坏和畸形。RA滑膜因其中的缺氧微环境、细胞大量增生和侵袭表型被认为是一种“肿瘤样组织”。已知有成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)、巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和中性粒细胞等多种细胞参与RA的发病机制。其中,FLS在RA滑膜中迁移、侵袭和增殖能力的增加,是RA滑膜增生和侵袭性血管翳形成的基础。有研究报道缺氧微环境可通过上调细胞骨架蛋白肌成束蛋白(fascin1,FSCN1)的表达,促进细胞的迁移与侵袭。本研究旨在探究RA滑膜缺氧微环境对FLS迁移和侵袭能力的影响及其可能的分子机制,为临床治疗或缓解RA病程提供新的靶点。方法1.本实验所用滑膜标本均取自于2015年9月至2017年4月期间,行关节镜和关节置换术的RA和骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者。其中,RA 8例,OA 15例。2.应用免疫组织化学染色法检测RA和OA滑膜中FSCN1和HIF-1α的表达;应用组织免疫荧光染色法分析RA和OA滑膜中FSCN1和HIF-1α表达的共定位;定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,q-PCR)检测FSCN1和HIF-1α的mRNA在RA和OA滑膜中的表达情况。3.采用联合酶消化法分离RA/OA FLS并体外培养,分别应用q-PCR和免疫印迹法(western blot,WB)检测FSCN1的mRNA和蛋白在RA/OA FLS中的基础表达。4.应用氯化钴造成实验性缺氧,模拟RA滑膜缺氧微环境。应用q-PCR、WB和细胞免疫荧光染色法检测实验性缺氧时RA FLS中HIF-1α表达的变化.5.应用q-PCR和免疫细胞化学染色法检测实验性缺氧时RA FLS中FSCN1表达的变化;应用RNA干扰技术降表达RA FLS中的HIF-1α;应用q-PCR和WB检测RA FLS中siHIF-1α的干扰效率及FSCN1的表达。6.应用Transwell法检测实验性缺氧及siHIF-1α对RA FLS迁移和侵袭能力的影响;应用MTT分析实验性缺氧对于RA FLS增殖能力的影响。7.应用WB评估STAT3通路在“缺氧调控RA FLS迁移和侵袭”这一过程中的作用。8.计量资料以x±s表示,两组资料间比较采用独立样本t检验;多组资料间比较采用单因素方差分析,再用SNK-q检验进行组间多重比较。检验水准为双侧α=0.05。所有数据均采用SPSS 16.0软件包进行分析。结果1.病理学结果显示,FSCN1和HIF-1α在RA滑膜高表达,主要分布于滑膜衬里层和衬里下层的细胞聚集区域,且FSCN1和HIF-1α可见大量共定位,HIF-1α与细胞核有较好共定位;而OA滑膜中FSCN1和HIF-1α呈弱表达。q-PCR结果显示,RA滑膜中FSCN1(4.4375±0.72780 vs.1.0000±0.51235,t=9.460,P0.001)和 HIF-1α(3.0435±1.64002 vs.0.9983±0.53323,t=2.905,P=0.027)的mRNA显著高于OA。2.成功分离RA/OA FLS并行体外培养,FLS形态呈典型的纺锤形或长梭形,旋涡状生长。q-PCR和WB结果显示,RA FLS中FSCN1的mRNA(2.9033±0.10786 vs.1.0000±0.01732,t=30.178,P=0.001)和蛋白(1.8733±0.14189 vs.1.0000±0.11790,t=8.200,P=0.001)水平均显著高于OAFLS。3.q-PCR、WB和细胞免疫荧光结果显示,实验性缺氧下调RA FLS中HIF-1α的mRNA表达(1.0000±0.10440 vs.0.2300±0.01000,t=12.716,P=0.006),上调HIF-1α的蛋白表达(F=4245.613,P0.001),促进HIF-1α蛋白的核转移。4.q-PCR和免疫细胞化学染色结果显示,实验性缺氧上调RA FLS中FSCN1的mRNA(1.0000±0.02646 vs.2.1900±0.02646,t=-55.086,P0.001)和蛋白的表达;q-PCR和WB结果显示,HIF-1α的干扰成功,其mRNA(1.0148±0.05677vs.0.4530±0.03010,t=15.143,P0.001)和蛋白(1.0000±0.01339 vs.0.6111±0.01954,t=28.433,P0.001)水平均显著降低;q-PCR和WB结果显示,siHIF-1α下调实验性缺氧时RA FLS中的FSCN1的mRNA(1.0012±0.05957 vs.0.5461±0.01764,t=12.688,P0.001)和蛋白(1.0000±0.00000 vs.0.6940±0.01878,t=28.221,P=0.001)水平。5.细胞迁移实验结果显示,实验性缺氧(55.6000±6.98570 vs.102.4000±5.68331,t=-11.620,P0.001)促进RA FLS的迁移;而HIF-1α的mRNA干扰后,RA FLS的迁移能力明显降低(102.4000±5.68331 vs.74.8000±7.69415,F=59.170,P0.001)。细胞侵袭实验结果显示,实验性缺氧(138.66667±4.72582 vs.198.6667±6.02771,t=-13.568,P0.001)促进RA FLS的侵袭;而HIF-1α的mRNA干扰后,RA FLS的迁移能力明显降低(190.3333±5.85947vs.148.3333±2.51661,F=142.912,P0.001)。MTT结果显示,实验性缺氧可显著抑制RA FLS的增殖,且其抑制能力与浓度呈正相关关系(F=577.700,P0.001)。6.WB显示实验性缺氧可显著上调RA FLS中FSCN1、HIF-1α的表达和STAT3的磷酸化。结论1.FSCN1和HIF-1α在RA滑膜均高表达,且二者存在共定位。2.缺氧条件下,HIF-1α通过上调FSCN1的表达,促进RA FLS的迁移和侵袭。3.STAT3通路可能参与“缺氧调控RA FLS迁移和侵袭”这一过程的调控。本研究结果提示RA滑膜缺氧微环境可能是FLS迁移和侵袭能力增加的重要原因,而FSCN1和HIF-1α则在其中起着至关重要的作用,RA FLS中“HIF-1α上调FSCN1的表达”可能同时接受STAT3通路的调控。
【图文】：

1 Expression of FSCN1 in RA/OA synovium (IHC.1 FSCN1在RA/OA滑膜的表达（免疫组化，20滑膜高表达表明，HIF-1α在RA滑膜高表达，呈弥散强；在OA滑膜表达呈弱阳性（见图1.22 Expression of HIF-1α in RA/OA synovium (IHC.2 HIF-1α在RA/OA滑膜的表达（免疫组化，20

202 Expression of HIF-1α in RA/OA synovium (IHC.2 HIF-1α在RA/OA滑膜的表达（免疫组化，201α在RA滑膜高表达，且存在共定位光结果表明，FSCN1和HIF-1α在RA滑膜定位，，双阳性区域表现为黄色，主要集中域（见图1.5）；而FSCN1和HIF-1α在OA于滑膜细胞的细胞浆（见图1.3），而HI上结果提示FSCN1和HIF-1α在滑膜局部CN1和HIF-1α之间可能存在某些未知联系
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R593.22

【参考文献】

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本文编号：2649997