细颗粒物对支气管哮喘患者肺功能的影响以及其对哮喘小鼠气道高反应性的作用和机制研究

发布时间：2020-05-05 20:09

【摘要】：空气污染物中的环境颗粒物(Particulate Matter,PM),特别是细颗粒物(Fine Particulate Matter,PM2.5),已成为许多国家,特别是中国北方地区最严重的环境和公共卫生问题之一。PM是一种来源复杂、构成复杂的混合物。PM2.5因其粒径小、比表面积大、含有大量的有毒、有害物质,并可以穿过细支气管到达肺泡甚至进入血液,而被认为是对肺部最有害的颗粒物。石家庄市作为京津冀地区的大城市之一,受交通相关污染、钢铁、水泥、冬季取暖等多重污染因素的影响,城区污染水平居于全国前列,并在中国190个城市因为颗粒物污染造成的疾病负担中居于第五位,占大气污染相关死亡总人数的2.02%。支气管哮喘(简称哮喘)是一种异质性疾病,通常以慢性气道炎症为特征,以气道高反应性(airway hyperresponsiveness,AHR)为病理生理特点。其发生和发展与暴露于外部介质(例如,上呼吸道病毒、尘螨和空气污染物等)有关。既往的流行病学调查表明,PM2.5暴露与哮喘的发病率、住院率、死亡率增加相关。目前在临床方面进行的PM2.5对哮喘患者的影响,主要集中在流行病学调查,与哮喘患者肺功能的直接相关性的研究较少。既往的PM2.5对哮喘患者肺功能的影响主要侧重在暴露时间内污染物平均浓度相对哮喘症状和肺功能的影响,缺乏点对点的PM2.5与哮喘患者每日肺功能变化的相关性的研究。在基础实验方面,缺乏模拟真实世界的PM2.5慢性暴露的动物模型,并且对于PM2.5慢性暴露是否加重气道高反应性、其致病机理如何均有待进一步研究。我们的研究分为两部分:第一部分为临床部分,观察短期暴露情况下石家庄市区内的每日大气污染物(含PM2.5和刺激性气体)指标与哮喘患者肺功能的相关性。研究涉及到不同个体连续监测的肺功能数据与连续的大气污染物数据,选用多水平混合效应模型进行统计分析,并对PM2.5进行滞后效应分析,较以往的研究更为精准全面。第二部分为动物实验部分。我们采用PM2.5多功能气溶胶浓缩富集系统对不同组小鼠进行为期8周的吸入暴露,观察对于卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏的小鼠的气道高反应性影响,并研究凋亡及T细胞免疫球蛋白和黏蛋白域1(T-cell immunoglobulin and mucin domain 1,TIM-1)在这个过程中的作用。第一部分细颗粒物对支气管哮喘患者肺功能的影响:短期暴露研究目的:观察短期暴露期间的每日空气污染物(包括细颗粒物和SO_2、NO_2、O_3)变化对于哮喘患者肺功能的影响。方法:采用观察性研究的方法,在2018年2月-2019年3月期间募集居住于石家庄市城区的支气管哮喘慢性持续期控制状态的患者,排除其他系统疾病后安排入组。基线期入组时记录其一般情况,核实临床诊断依据等。入组后发放肺功能仪记录患者每日最大呼气流速(peak expiratory flow,PEF),用力肺容积(Forced vital capacity,FVC),FVC占预计值百分比(FVC%),第一秒用力呼气容积(Forced expiratory volume in one second,FEV1),FEV1占预计值百分比(FEV1%),一秒率(FEV1/FVC),及反应小气道情况的75%用力呼气流速(Maximal expiratory flow at 75%,MEF75),50%用力呼气流速(Maximal expiratory flow at 50%,MEF50),25%用力呼气流速(Maximal expiratory flow at 25%,MEF25),连续监测10天,测试结果自动上传储存。同时自石家庄市环保局获得相应日期的大气细颗粒物及有毒气体(包括SO_2、NO_2、O_3)情况。汇总所得数据采用多水平混合效应分析模型构建统计模型,分别对每日PM2.5固体颗粒物和SO_2、NO_2、O_3三种刺激性气体对哮喘患者每日肺功能的影响进行单因素分析,并对PM2.5进行滞后效应分析,根据单因素分析结果再进行多因素分析。结果:1.入组42名患者,其中男性14名,女性28名,男女两组患者之间BMI值,用药剂量等级等无明显差异。2.PM2.5固体污染物单因素(含滞后)的混合效应模型固定效应估计结果显示:PM2.5的0阶滞后值与肺功能参数值PEF(z=-2.28,P=0.023)、FVC(z=-2.51,P=0.012)、FEV1%(z=-2.18,P=0.029)、FEV1(z=-2.21,P=0.027)的变异呈负相关。PM2.5的1阶滞后值与肺功能各参数值均无相关性。3.SO_2、NO_2、O_3刺激性气体污染物单因素的混合效应模型固定效应估计结果示:O_3与PEF(z=-2.16,P=0.030)的变异呈负相关。4.PM2.5和O_3联合的多因素的混合效应分析显示:,PM2.5(z=-2.54,P=0.011)和O_3(z=-2.37,P=0.018)均显示与PEF变异的方差有显著差异,呈负相关。同时两者交互效应分析中,PM2.5仍显示与FEV1(z=-2.17,P=0.030)、FEV1%(z=-2.30,P=0.028)的变异的呈负相关,再次证实PM2.5可对FEV1及FEV1%的变化具有一定的负向影响。小结:42名哮喘患者不同时间段内,连续为期10天的短期观察中:1.PM2.5与哮喘患者的PEF、FEV1、FEV1%、FVC负相关,对于反应小气道功能的MEF25、MEF50、MEF75值没有显著影响。进行PM2.5滞后1天效应统计无显著相关性。2.O_3每日最大8小时对PEF值呈负相关,SO_2、NO_2未发现对肺功能有显著效应。3.PM2.5和O_3联合分析,两者均与PEF呈负相关,PM2.5仍对FEV1、FEV1%呈负相关。第二部分细颗粒物加重哮喘小鼠气道高反应性的作用及其机制研究目的:本研究的目的是观察连续8周高浓度的PM 2.5吸入对于已经采用OVA致敏的哮喘小鼠的病理和气道高反应性的影响,同时观察细胞凋亡和TIM-1在这个过程中的作用。方法:1.试验动物分组及暴露方案:40只BALB/c小鼠被分为4组:对照组,OVA组,OVA/PM组,PM组(n=10)。所有小鼠饲养于独立通风笼(individually ventilated cages,IVCs)。对照组每日在固定器内固定4小时,每周5天,连续8周。OVA组采用OVA致敏和激发,OVA/PM组采用OVA组同样的方法致敏和激发,同时,将小鼠固定在PM 2.5多功能气溶胶浓缩富集系统的口鼻暴露器上,每日4小时,每周5天,连续8周,吸入浓缩的PM 2.5,此项操作在河北省石家庄市河北医科大学第二医院雾霾实验室进行。PM组仅仅给予吸入浓缩的PM 2.5。2.检测指标及方法:在试验过程中采用聚丙烯膜和石英膜分别收集与小鼠一致的暴露管道内的颗粒物,并分析其成分。PM2.5暴露8周后,进行AHR检测,收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)进行细胞计数。采用酶联免疫法检测BALF中的白细胞介素4(interleukin-4,IL-4),白细胞介素5(interleukin-5,IL-5)和白细胞介素33(interleukin-33,IL-33)的浓度。通过光学显微镜检查肺组织学结构,并通过电子显微镜观察超微结构。采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling,TUNEL)法检测肺组织中凋亡细胞的表达。利用免疫印迹法和免疫组织化学法检测肺组织中的Bcl-2、Bax和TIM-1表达。3.统计学分析:数据用均数±标准差(SD)表示,采用SPSS 19.0版软件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)进行分析。采用单因素方差分析(One-Way analysis of variance,One-Way ANOVA)评价不同组之间的差异。P0.05为差异有统计学意义。结果:1.颗粒物浓度及成分分析:BALB/c小鼠在连续8周暴露期间,日均暴露浓度为703μg/m~3,暴露颗粒成分分析显示质量浓度占据前五位的分别是NO_3~-、有机碳(Organic carbon,OC)、SO_4~(2-)、NH_4~+和元素碳(elemental carbon,EC)。2.肺组织病理及电镜下显微结构观察:OVA/PM组气管上皮细胞轻度缺失,肺泡间隔较宽,炎性细胞浸润,小支气管平滑肌增生。PM组显示细支气管周围的炎性细胞浸润和肺泡上皮增生。电镜下观察OVA/PM组和PM组线粒体异常,核膜与线粒体嵴轻度融合退化。3.呼吸力学和AHR:OVA/PM组小鼠气道反应性相对于OVA组和PM组明显升高(P0.05),而仅暴露PM 2.5组小鼠AHR相对于对照组也有明显升高(P0.05)。4.BALF中的细胞分类计数及细胞因子测定:OVA/PM组(28±6.08 vs12.33±4.51,t=4.631,P=0.002)和PM组(29.00±3.00 vs 12.33±4.51,t=4.927,P=0.001)的BALF中淋巴细胞数量较对照组显著增高.OVA/PM组(6.67±1.53 vs 3.33±1.53,t=2.886,P=0.020)和PM组(6.67±1.53 vs3.33±1.53,t=2.886,P=0.020)的BALF中中性粒细胞数量较OVA组比较显著升高。IL-4(77.44±11.19 vs 48.02±10.02 pg/ml,t=4.595,P=0.002)和IL-5(15.65±1.19 vs 12.35±0.95 pg/ml,t=3.806,P=0.005)的浓度在OVA/PM组较OVA组比较显著增加。IL-4(77.44±11.19 vs 41.47±3.40pg/ml,t=5.617,P=0.001)和IL-5(15.65±1.19 vs 10.99±1.40 pg/ml,t=5.374,P=0.001)的浓度在OVA/PM组较PM组比较显著增加。IL-4(41.47±3.40 vs 25.46±2.98 pg/ml,t=2.501,P=0.037)浓度在PM组较对照组比较显著增加。5.凋亡细胞表达:TUNEL检测显示OVA/PM组凋亡细胞数目显著高于OVA组(Tunel immunohistochemical scores[IHS%],1.20±0.18 vs 0.51±0.03,t=8.094,P0.001)和PM组(Tunel IHS%,1.2±0.18 vs 0.51±0.09,t=8.094,P0.001),PM组凋亡细胞数目显著高于对照组(Tunel IHS%,0.51±0.09 vs 0.26±0.03,t=2.894,P=0.020)。6.Bax/Bcl-2和TIM-1表达:Bax/Bcl-2比(1.51±0.18 vs 0.48±0.10,t=9.654,P0.001)和TIM-1/β-actin比(0.78±0.11 vs 0.40±0.06,t=6.818,P0.001)在OVA/PM组较OVA组比较显著增加。Bax/Bcl-2比(1.51±0.18 vs 0.97±0.16,t=5.000,P=0.001)和TIM-1/β-actin比(0.78±0.11 vs 0.31±0.06,t=8.545,P0.001)在OVA/PM组较PM组比较显著增加。Bax/Bcl-2比(0.97±0.16 vs 0.18±0.03,t=7.439,P0.001)和TIM-1/β-actin比(0.31±0.06 vs 0.02±0.01,t=5.109,P=0.001)在PM组较对照组比较显著增加。小结:PM 2.5可导致OVA敏化的哮喘小鼠气道高反应性加剧,肺部炎症病理加重,这一过程与凋亡及TIM-1激活可能有关。本研究将为PM2.5致哮喘的预防和治疗提供了一个新的靶点。结论:从临床上,可观察到PM2.5升高可导致哮喘患者的PEF、FEV1、FEV1%、FVC降低,PM2.5对滞后1天的肺功能无显著影响。在动物实验中,采用高浓度PM 2.5吸入暴露8周可导致OVA敏化的哮喘小鼠气道高反应性加剧,肺部炎症病理加重,这一过程与凋亡及TIM-1激活可能有关。
【图文】：

小鼠,孝感,美国,微镜

图 1 小鼠 PM2.5 口鼻暴露系统 nose-only PM2.5 inhalation system(HRH-MNE3Technology Co. Ltd, Beijing).器 Haier，中国箱 Haier，中国箱 Thermo Scientific液器 Eppendorf，，美国心机 Thermo Scientific速离心机 Thermo Scientific Bio-Tek，美国微镜 ZEISS，德国埋机孝感泰康达医疗设

暴露浓度,石环,浓度,集系

在小鼠暴露期间，平均每日环境 PM2.5 浓度是 94μg / m3（从石环保局获得）。除去未暴露时间和周末（实际暴露天数是 38 天）平均每日环境 PM2.5 浓度是 101μg / m3。根据 PM2.5 多功能气溶胶集系统实时显示数据（每 5 分钟自动储存实时数据），计算暴露时M2.5浓度（图 2），日最高暴露浓度 3016μg / m3，最低暴露浓度是 1m3，平均每日暴露浓度为 703μg / m3。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R562.25

【参考文献】