ApoM基因的缺失对肝肾糖代谢相关性功能的影响

发布时间：2020-05-06 14:36

【摘要】：目的:通过观察ApoM-S1P对小鼠肝脏糖代谢及相关信号通路的影响和ApoM基因表达下调对肾小球系膜细胞凋亡水平的改变,进而初步探究ApoM与糖代谢及2型糖尿病之间的潜在关联性。方法:利用ApoM基因缺失型小鼠和肝细胞模型、ApoM基因过表达小鼠肝细胞模型、ApoM基因表达受干扰小鼠肾小球系膜细胞模型。通过糖刺激实验检测ApoM基因缺失对葡萄糖代谢的影响;利用qPCR和Western-blot分别检测ApoM基因缺失后肝脏糖代谢相关酶和胰岛素信号通路关键蛋白的表达变化;通过Western-blot检测ApoM基因过表达后肝细胞中糖代谢相关信号通路关键蛋白的变化情况;采用Western-blot检测加入S1P生物活性制剂后对ApoM缺失型肝细胞糖代谢相关信号通路关键蛋白表达水平的影响;通过透射电子显微镜观察ApoM基因缺失后小鼠肾脏的形态变化;通过Western-blot、DAPI染色以及细胞流式术观察ApoM表达下调对小鼠肾脏凋亡水平的影响。结果:1.葡萄糖含量的持续上升下调了小鼠肝细胞AML12中ApoM的表达水平(P0.05)。2.经不同浓度葡萄糖刺激24小时后,ApoM基因缺失的AML12细胞培养液中糖浓度相较于正常对照组升高(P0.05)。3.ApoM基因缺失后,小鼠肝脏组织和肝细胞中糖异生关键酶G6PC的mRNA水平增高(P0.05)。4.ApoM基因缺失后小鼠肝细胞AML12中Akt、GSK3β、AS160以及AMPKα的表达水平与正常对照组相比无显著差异(P0.05)。而p-AKT ser473、p-GSK3βser9、p-As160 ser588以及p-AMPKαThr172的表达水平相较于正常对照组均显著下降(P0.05),提示ApoM基因的缺失导致小鼠中葡萄糖信号转导途径的转导紊乱。5.使用AdEasy重组腺病毒系统构建过表达ApoM基因的小鼠肝细胞模型。6.在ApoM基因缺失的小鼠肝细胞AML12中重新过表达ApoM,p-GSK3βser9、p-As160 ser588重新恢复到与正常细胞接近的水平。7.在ApoM基因缺失的肝细胞中加入S1P,导致原先表达水平下调的p-AKT ser473、p-GSK3βser9、p-As160 ser588以及p-AMPKαThr172的表达水平显著上调(P0.05),基本与正常细胞一致。8.在体水平ApoM基因的缺失导致S1PR1、S1PR3、S1PR4以及S1PR5的mRNA水平显著下降(P0.05),S1PR2的mRNA水平改变无统计学意义。离体水平与在体水平结果基本一致。9.使用S1PR1与S1PR3的抑制剂VPC23019孵育正常小鼠肝细胞AML12,p-AKT ser473、p-As160 ser588以及p-AMPKαThr172的表达水平显著下降(P0.05)。使用S1PR2抑制剂JTE013,p-AKT ser473、p-As160 ser588以及p-AMPKαThr172的表达水平无明显改变。10.ApoM基因缺失小鼠肾脏的线粒体出现外室肿胀、空泡化以及髓样变,并且大量粗面内质网异常扩张。抑制ApoM基因表达的系膜细胞增殖减少,细胞核内出现染色质凝集、核固缩以及核裂解。11.ApoM基因表达受抑制导致小鼠肾脏及肾小球系膜细胞中AIF、Bax、chop、p-JNK、clever-caspase9、clever-caspase12、clever-caspase7以及clever-caspase3的表达水平显著上调(P0.05),Bcl2的表达水平显著下降(P0.05)。提示ApoM表达水平的下降通过线粒体和内质网途径上调小鼠肾脏及肾小球系膜细胞的凋亡水平。结论:1.ApoM基因的缺失导致小鼠肝脏糖代谢异常及相关信号通路转导障碍。2.ApoM可能通过S1P/S1PR1/S1PR3调节小鼠肝脏糖代谢相关信号通路的转导。3.ApoM表达水平的下调通过线粒体及内质网途径上调小鼠肾脏及肾小球系膜细胞的凋亡水平。
【图文】：

但当加入的葡萄糖浓度达到 15mM 时 ApoM 的表达水平显著下降（P<0.03，图1-1B）。图 1-1 不同浓度葡萄糖培养条件下各组 AML12 细胞的形态结构及 ApoM 的表达水平（A）20 倍镜下观察各组细胞形态结构，各组 AML12 细胞形态结构未发生明显改变;（B）利用 WB 检测 AML12 细胞在不同糖浓度刺激下 ApoM 的表达水平。**p<0.03。Fig. 1-1 Morphological structure and ApoM expression levels of AML12 cells in different

) The morphological structure of each group was observed under the microscope at 20mes. The morphological structure of AML12 cells in each group did not changegnificantly; (B) The expression level of ApoM in AML12 cells stimulated by different sugaroncentrations was detected by WB. **p<0.03. 高糖环境中 ApoM 基因缺失的肝细胞培液中葡萄糖含量增多在 AML12-GFP 与 AML12-ApoM-/-细胞完全培养液中分别加入 1 mM、2M、5 mM、10 mM 以及 15 mM 浓度的葡萄糖并孵育 24 小时，，利用葡萄糖检试剂盒检测培养液中糖浓度。如图 1-2 所示，在 5 mM 到 10 mM 浓度的葡萄刺激 24 小时，AML12-ApoM-/-组细胞培养液中的糖浓度明显高于 AML12-GFP（Glucose 5 mM，P<0.01；10 mM，P<0.03）。上述两个 ApoM 与高糖之间的向实验提示 ApoM 与糖代谢之间关系密切。
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.1

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本文编号：2651426