O-GlcNAc水平升高导致的胰岛素敏感性降低与高聚体脂联素水平的下降有关

发布时间：2020-05-11 23:29

【摘要】：【目的】:通过提高脂肪细胞内蛋白质O-GlcNAc水平,探索细胞内脂联素水平变化,以及细胞胰岛素敏感性及糖脂代谢的变化情况。【方法】:以3T3-L1成纤维细胞为实验对象,应用传统的鸡尾酒法诱导其成脂分化为成熟的脂肪细胞,在诱导分化的第10天对细胞进行油红染色鉴定脂肪细胞是否分化成熟。(1)分化成熟的脂肪细胞随机分为两组,每组至少重复3次实验。实验组给予含有100umol/L的O-GlcNAc修饰的关键酶O-GlcNAcase(OGA)的抑制剂PUGNAc的DMEM无血清培养基继续培养细胞,对照组仅以不含血清的DMEM培养基培养,16小时后,取细胞上清液测剩余葡萄糖浓度;用预先加入了PMSF的RIPA细胞裂解液裂解细胞提取蛋白质,BCA法测定细胞提取物中总蛋白质的浓度,Western Blotting法测定细胞细胞中蛋白质的O-GlcNAc修饰的水平,糖基化修饰相关OGA、OGT水平以及总脂联素、高聚体脂联素(HMW)、p-AMPK/AMPK水平和p-Akt/Akt水平。(2)完成PUGNAc干预培养或空白对照培养16小时后,两组用无菌PBS缓冲液轻轻漂洗细胞两次,然后均给予含有10nmol/L的胰岛素、葡萄糖浓度为25mmol/L的DMEM培养基继续培养,1小时后提取细胞培养上清液,用生化分析法检测细胞培养上清中剩余葡萄糖(GLU)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、总胆固醇(Chol)及甘油三酯(TG)的水平;Western blotting法检测蛋白提取物中p-Akt/Akt水平。用脂滴特异性荧光染色剂Bodipy对脂肪细胞进行染色,荧光免疫试验检测细胞内p-AMPK水平,荧光显微镜下观察。【结果】:结果显示:(1)成功诱导脂肪前体细胞分化为脂肪细胞。分化后细胞分为两组进行药物PUGNAc干预和空白对照。(1)经Western blotting检测显示,与对照组相比,PUGNAc处理组的3T3-L1脂肪细胞,其总蛋白质O-GlcNAc水平明显升高(P0.05),同时伴随OGA的水平也升高(p0.05),差异具有统计学意义;而蛋白质OGT水平无明显变化(P0.05);(2)检测胰岛素处理前、后细胞上清液剩余葡萄糖浓度,结果显示,与对照组相比,PUGNAc处理组细胞上清液剩余葡萄糖浓度均较高,其葡萄糖摄取率较对照组均较低(葡萄糖摄取率等于培养初始时葡萄糖浓度减去培养终点时剩余葡萄糖浓度)(P0.05);而其细胞上清中LDL-C水平较对照组升高(P0.05),两组之间对比,差异有意义,脂肪细胞荧光染料Bodipy染色示PUGNAc组脂肪细胞外脂滴增大增多;(3)PUGNAc处理组其细胞总脂联素(APN)水平较对照组高,但高聚体脂联素(HMW)水平较对照组低,HMW/总APN比例下降;P值均0.05,差异有意义;(4)O-GlaNAc水平升高,P-AMPK水平下降,P-AMPK/AMPK比例下降(P0.05)。未经胰岛素刺激情况下,两组p-Akt/Akt水平无明显变化(P0.05);经胰岛素刺激后,PUGNAc处理组p-Akt/Akt水平较对照组下降(p0.05)。【结论】脂肪细胞内蛋白质O-GlcNAc修饰水平升高,细胞对胰岛素的敏感性降低,糖脂代谢功能紊乱,可能与高聚体脂联素水平下降有关。
【图文】：

脂肪,油红,情况,脂肪细胞

华中科技大学硕士学位论文实验结果1. 3T3-L1 脂肪前体细胞诱导分化第 10 天，脂肪细胞经油红染色鉴定细胞是否分化完全。如图 1（a）所示，未分化的前体细胞显微镜下放大 200 倍呈不规则纤维状，细胞贴壁紧密；如（b）所示，脂肪细胞经分化完成后，油红染色镜下可见细胞形态为圆形或近似圆形，细胞周围可见红色脂滴包绕，，表明细胞分化完全。

无血清培养基,胰岛素,统计学意义,脂滴

3.表示两组细胞在含胰岛素培养基的无血清培养基中培养 1 小时后细胞上清脂类的含量，*表示与对照组相比 P<0.05,n=3，差异有统计学意义。（a）表示组上清液 TG 的比较，（b）表示两组之间 LDL-C 水平比较。（c）、（d）分别表示组之间 HDL-C、TC 的水平比较。.脂滴荧光染料 Bodipy 染色显示细胞外脂滴大小。高聚体脂联素能够促进脂质分解，防止脂质沉积。通过 Bodipy 染色了解脂细胞外脂滴堆积情况。如图所示，PUGNAc 处理脂肪细胞脂质分解减弱，脂滴积大，呈圆形密集堆积，而对照组脂滴体积小，脂质堆积少。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R589

【参考文献】