多胺代谢在自身免疫性甲状腺疾病发病机制中的作用及机制研究

发布时间：2020-05-12 20:14

【摘要】：目的:自身免疫性甲状腺疾病(AITDs)主要包括桥本甲状腺炎(HT)和Graves病(GD),是常见的器官特异性自身免疫疾病。AITD的发生发展可能与遗传和环境因素相关,但是其具体发病机制尚不清楚。代谢组学是系统生物学领域的一个新兴领域,研究对象多为相对分子量小于1kDa的小分子物质。代谢组学的研究目的是测量疾病发生发展过程中发生改变的代谢途径,并寻找与疾病相关的生物标志物。在人体内的众多代谢产物中,多胺是所有活细胞中不可缺少的聚合阳离子,多胺在甲状腺生长以及核酸代谢过程中起着重要的调节作用。最常见的功能性多胺主要为腐胺(PUT)、精胺(SPM)和亚精胺(SPD)。多胺,特别是SPM和SPD在活细胞中发挥着重要的生理功能,包括离子通道的调节、基因的转录和翻译以及抗氧化损伤等。多胺代谢异常已被证实与多种自身免疫疾病有关,包括多发性硬化、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等。然而多胺在AITD发病中的作用及机制尚不清楚。因此,本研究旨在评估AITD患者和健康对照组血清和甲状腺组织中多胺代谢产物水平,并预测甲状腺激素、甲状腺自身抗体、趋化因子、DNA/组蛋白整体甲基化水平以及AITD疾病进展是否与多胺代谢相关。并进一步在自发自身免疫性甲状腺炎动物模型NOD.H-2~(h4)小鼠实施多胺(精胺和亚精胺)干预治疗,观察多胺对自发性自身免疫性甲状腺炎炎症的影响以及抗体水平的变化,为临床干预治疗提供动物实验依据。研究方法:第一部分:收集98例AITD患者,包括33例HT患者,36例GD患者,29例甲状腺抗体阳性(pTAb)患者和38例性别、年龄匹配的健康对照的外周血全血及血清。另收集20例HT患者的甲状腺组织以及健康对照的甲状腺组织20例。电化学免疫发光法检测血清中游离T3(FT3),游离T4(FT4),促甲状腺激素(TSH),甲状腺球蛋白抗体(TgAb)及甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)。超高液相色谱-串联质谱法检测血清以及甲状腺组织中多胺含量。血清中进行多胺代谢组学研究,共检测14中多胺代谢产物,分别为多胺前体,多胺和多胺下游代谢产物。多胺前体主要包括S-腺苷甲硫氨酸(SAM),L-精氨酸(L-ARG),L-鸟氨酸(L-ORN)和赖氨酸(LYS);多胺包括腐胺(PUT),精胺(SPM),亚精胺(SPD),尸胺(CAD),胍丁胺(AGM),1,3-丙二胺(DAP),N-乙酰化亚精胺(NSPD),N-乙酰化腐胺(NPUT)和N-乙酰化精胺(NSPM);γ-氨基丁酸(GABA)是腐胺的下级代谢产物。甲状腺组织研究中主要检测3种功能性多胺(PUT,SPM,SPD)。流式磁珠(CBA)技术检测5种血清趋化因子(MCP-1,IP-10,IL-8,RANTES,MIG)。提取甲状腺组织以及PBMC总RNA,real-time PCR检测多胺代谢关键酶SSAT、SMS、SDS、ODC、AMD mRNA表达水平和DNA/H3K9甲基化关键酶DNMT1、G9A mRNA表达水平。酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测PBMC和甲状腺组织中DNA和H3K9整体甲基化水平。第二部分:选取4周龄NOD.H-2~(h4)小鼠,随机分为对照组(给予普通饮水)和高碘饮水组(给予1000倍高碘饮水)。高碘组给予1000倍高碘饮水8周后分为3组:甲炎补SPD组(SAT+SPD),甲炎补SPM组(SAT+SPM),甲炎组(SAT),每组10只。各组实验动物于补充多胺4周后麻醉处死并采集标本。留取小鼠甲状腺组织,HE染色观察淋巴细胞浸润情况。ELISA法测定小鼠血清甲状腺球蛋白(TgAb)水平。超高液相色谱-串联质谱检测脾中SPM和SPD含量。ELISA检测炎性细胞因子。real-time PCR检测小鼠脾组织中多胺代谢关键酶SSAT、SMS、SDS、ODC、AMD mRNA表达水平。结果:第一部分:1、AITD患者血清中代谢组学研究共检测了14种多胺代谢产物,GD和HT组呈现出许多类似的多胺代谢产物变化:GD和HT组血清中的L-ORN,L-ARG,LYS和AGM均明显高于对照组(P0.05),而PUT,NPUT,SPM和DAP则显著低于对照组(P0.05)。此外,GD和HT组相比于对照组也存在着些许多胺代谢模式的差异:GD组的SPD,NSPD,GABA明显升高(P0.05),CAD水平明显降低(P0.05);而HT的NSPM水平呈现出明显降低(P0.05)。pTAb组相比于对照组仅表现为明显降低的血清SPM和NSPM水平,其他代谢产物并未显示出统计学差异。2、GD,HT和pTAb三组血清中的炎性趋化因子IP-10含量均明显高于对照组;GD组较对照组呈现出高水平的MCP-1水平(P0.05),而HT和pTAb组的MCP-1较对照组并无统计学差异。3、所有AITD患者(GD,HT,pTAb)的SPM与SPD的比值(SPM/SPD)均显著低于对照组,SPM/SPD与TPOAb呈现出强负相关(r=-0.569,P0.01)。4、logistic回归分析显示血清NSPD可能是单纯抗体升高患者进展为临床甲减的危险因素(OR=1.269;95%CI:1.023-1.574;P=0.031)。5、血清SPM与甲状腺特异性抗体滴度(TPOAb和TgAb)呈负相关性。6、HT和GD组PBMC中的SSAT mRNA水平均明显高于对照组;HT和GD组的SMS mRNA水平明显低于对照组。7、HT患者甲状腺组织中的SPM含量明显低于对照组,且SPM与TPOAb呈明显负相关性(r=-0.332,P0.05)。另外,HT患者的甲状腺组织中SSAT mRNA水平明显高于对照组(P=0.0190.05)。8、无论在PBMC还是甲状腺组织中,各组DNA和H3K9整体甲基化水平及其关键酶(DNMT1和G9A)均较对照组无统计学差异。第二部分:1、SAT组小鼠甲状腺相对重量较对照组明显增加(P0.05),SAT+SPD组小鼠的甲状腺相对重量明显低于同时点SAT组小鼠(P0.05),SAT+SPM组小鼠的甲状腺相对重量与同时点SAT组未呈现出统计学差异。2、SAT组的血清TgAb滴度明显高于对照组(P0.05)。SAT+SPD组的TgAb滴度明显低于同时点SAT组(P0.05),SAT+SPM组的TgAb滴度与同时点SAT组无统计学差异。3、SAT+SPD组的组织学评分明显低于SAT组(P0.05),SAT+SPM组与SAT组的组织学评分无统计学差异(P0.05)。SAT+SPD组相比于SAT组可见到滤泡腔变小,但并未恢复到补碘前水平;滤泡上皮细胞及细胞核形态有所恢复;淋巴细胞浸润程度明显减轻。SAT+SPM组淋巴细胞浸润程度也有所减轻。4、SAT+SPD组的TNF-a、IL-12、IP-10显著低于SAT组(P0.05)。SAT+SPM组的IL-12、IP-10明显低于SAT组(P0.05)。5、SAT组的SSAT mRNA表达水平明显高于对照组(P0.01)、SAT+SPD组(P0.01)以及SAT+SPM组(P0.05)。6、SAT组的精胺和亚精胺含量均明显低于对照组(P0.05),补充SPD的甲炎小鼠脾组织中的SPD明显高于SAT组(P0.05),补充SPM的甲炎小鼠脾组织中的SPM明显高于SAT组(P0.05)。结论:1、GD和HT的大部分多胺代谢物表现出相似的模式,提示这两种疾病之间可能存在共同的病理生理基础或代谢途径。2、NSPD可能是单纯抗体升高进展为临床甲减的一个危险因素(OR=1.269;95%CI:1.023-1.574;P=0.031),SPM是甲状腺特异性抗体(TPOAb和TgAb)升高的保护因素(OR=0.988,95%CI=0.979-0.997,P=0.009)。3、SPM/SPD在GD,HT和pTAb组中均明显减少,这意味着多胺的抗炎作用降低;同时SPM/SPD与TPOAb,IP-10呈负相关,因此推测降低的SPM/SPD可能与炎症的消耗有关。4、GD和HT的PBMC中多胺代谢酶SSAT表达上调,精胺合酶SMS表达下调。HT患者甲状腺组织中SSAT表达上调。SSAT表达异常可能是AITD患者血清和甲状腺组织中多胺代谢异常的原因之一。5、虽然AITD患者外周血和甲状腺组织中证实了出现多胺循环紊乱,但不足以导致DNA/组蛋白甲基化出现异常。6、SPD干预治疗可以明显减轻NOD小鼠碘致甲状腺肿。补充SPD后NOD小鼠自身免疫甲状腺炎的炎症程度和血清TgAb水平明显降低。7、补充SPD后小鼠脾组织中的TNF-a、IL-12、IP-10明显降低,补充SPM组的IL-12、IP-10明显降低;提示SPD、SPM具有抗炎作用。8、甲炎组小鼠的多胺关键酶SSAT mRNA水平明显高于对照组,提示SAT的多胺代谢异常可能与SSAT表达异常有关。
【图文】：

功能图,多胺,趋化因子,炎性

同时也是一种的常见的中枢抑制性神经 S-腺苷甲硫氨酸（SAM），L-精氨酸（L-ARG），LS）。SAM 脱羧成为 dcSAM 后参与到精胺和亚精胺DNA 或组蛋白发生甲基化的甲基供体，，因此 SAM调控[25]。L-精氨酸一方面会在精氨酸酶的作用下生的作用下生成腐胺；另一方面，精氨酸还会生成 N，能够介导血管舒张，影响线粒体功能同时具有巨外源性补充精氨酸后会引起结肠和血液中的亚精胺胺的合成酶和代谢酶受多种因素的调节，包括氧化子等[29]。免疫细胞聚集在炎症位点会产生促炎症因转录因子 NF-κ B 和 NRF2 来影响多胺合成代谢酶[30]。机体通过严格的调控从而使多胺的合成和代谢

标准品,趋化因子,离心管

流式磁珠技术（CBA）检测血清趋化因子制备趋化因子标准品 (MCP-1，IP-10，IL-8，RANTES，MIG)）打开一瓶冻干的人趋化因子标准品转移至 15ml 离心管中（标注为最），加入 4ml 标准品稀释液，使用吸管轻柔混合，不可涡旋或剧烈混至少 15 分钟。）准备 8 只 15ml 离心管，分别标注为：1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1，分别吸取 300ul 标准品稀释液加入各离心管中。）吸取最高浓度标准品 300ul 加入到 1：2 稀释管中，使用吸管轻柔混 1：2 稀释管中的 300ul 液体加入到 1：4 稀释管中，依此类推（图 2.BA 104.1 87.1 40 8 14二胺 117.1 100.1 35 9 14
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R581

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