白杨素抗肥胖的作用靶点筛选及验证

发布时间：2020-05-12 17:33

【摘要】：目的:肥胖是一种危害人类健康的世界性的疾病,其发病机制主要与代谢性慢性炎症相关,目前依然没有找到一种安全有效的药物能够治愈肥胖。中药木蝴蝶中提取的白杨素具有良好的抗肥胖功效,但作用靶点及机制仍不清楚。本研究利用蛋白质组学及基因沉默筛选并验证白杨素抗肥胖的作用靶标,为其应用提供科学依据。方法:胰岛素诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,0.5mmol/L棕榈酸建立脂肪细胞肥大模型,以50umol/L白杨素进行干预;双向电泳分析正常组、模型组及白杨素组的差异蛋白,以液质联用质谱联合飞行时间串联质谱对差异蛋白进行鉴定,获得候选靶标蛋白;通过基因沉默、紫外光谱及荧光光谱分析确证白杨素抗肥胖的靶标蛋白。结果:棕榈酸组(模型组)中脂肪细胞内脂滴形成较正常组及白杨素组明显增加;双向电泳得到各组蛋白质谱后通过分析比较,得到在模型组中较正常组明显增高或降低2倍及以上的蛋白点(p0.05),白杨素组中与正常组相差小于2倍的蛋白质点共有8个,液质联用质谱鉴定后得到8个蛋白,分别是T复杂蛋白1亚基ε(T-complex protein 1 subunit epsilon)、膜联蛋白 A2(annexina2)、26S蛋白酶调节亚基8(26S protease regulatory subunit 8)、琥珀酰辅酶A转移酶(Succinyl-CoA:3-ketoacid coenzyme A transferase 1)、热休克蛋白 60(60 KDa heat shock protein)(在模型组中升高),以及T复合蛋白1亚基β(T-complex protein 1 subunit beta)、非均质核核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein)及 14-3-3 信号转导蛋白 epsilon 亚型(14-3-3 protein epsilon)(在白杨素组中降低)。飞行时间串联质谱进行鉴定验证显示,有4个蛋白鉴定结果与液质联用结果相同,分别是热休克蛋白60、及膜联蛋白A2、琥珀酰辅酶A转移酶以及T复杂蛋白1亚基ε。排除掉非特异性与细胞及蛋白质结构相关的蛋白点,将候选蛋白锁定为热休克蛋白60、及膜联蛋白A2、琥珀酰辅酶A转移酶及26S蛋白酶调节亚基8之中。通过基因沉默及甘油三酯验证结果显示:将膜联蛋白A2、热休克蛋白60、及琥珀酰辅酶A转移酶相关基因(ANXA2、HSPD1以及SCOT1)沉默后,棕榈酸诱导的3T3-L1细胞中甘油三酯形成分别减少30%,45%及40%(p0.05),而26S蛋白酶调节亚基8(PSMC5)沉默后甘油三酯未见减少。紫外光谱结果显示,白杨素的加入可以使膜联蛋白A2、热休克蛋白60的肽键及络氨酸特征峰处发生峰值增加及波长的改变,但对琥珀酰辅酶A转移酶的影响不明显。除此之外,荧光光谱结果进一步显示,白杨素可与膜联蛋白A2及热休克蛋白60形成稳定复合物以确定其药物与靶标之间的关系。结论:经过筛选和验证,白杨素发挥抗肥胖的作用靶点是膜联蛋白A2和热休克蛋白60,其作用机制可能是白杨素分别对膜联蛋白A2/MAPK通路及热休克蛋白60/myd88通路发挥抑制作用,影响这两个炎症信号通路在脂肪细胞内的激活,从而发挥抗肥胖作用。
【图文】：

对灰度值相差大于等于２倍（Ｐ＜０．邋０５），白杨素组与模型组中灰度值相差大于等逡逑于２倍（Ｐ＜０．邋０５），白杨素组与正常组灰度值相差不大（Ｐ＞０．邋０５）的蛋白质点，逡逑—共有８个（如图３所示），ＳＳＰ编号分别为１２０２，邋２４０２，１４０４，４５０３，，邋５５０２，逡逑９１０４，邋７５０１，邋７３０２。逡逑ｐＨ邋３邋逦？邋ｐＨ邋Ｋ）邋ｐＨ邋３邋逦？邋ｐＨ邋１０邋ｐＨ邋３邋逦？邋ｐＨ邋１０逡逑Ａ逦Ｂ逦．邋ｃ逦．逦｜逦＝逡逑■心拿灥：：ｉ逡逑＜４Ｐ｜Ｍｉｋｉ．逦ｍ逦？逦ｉｔｆ逡逑Ｊ２０？逦￣逦一逦NB．，．乻逡逑９１０４逦＊逦．逦９１０４逦服逦９１０４逦？逡逑？逦ｉ．ｉｉｉ｜ＳＰ逦．逦１ＳＫＩ）逡逑

本文编号：2660588