丁酸钠诱导RAW264.7细胞的自噬以及对破骨细胞分化及功能作用的初探

发布时间：2020-05-13 16:41

【摘要】：肠道菌群对宿主胃肠道、免疫以及神经系统等均起着关键的作用,其甚至可以通过影响免疫系统来调节骨密度(Bone Mineral Density,BMD)。盲肠和大肠中的肠道菌群通过发酵不易在小肠中消化的膳食纤维或者抗性淀粉产生短链脂肪酸(Short Chain Fatty Acids,SCFAs),参与调节人体能量代谢,其中对于丁酸钠(Sodium Butyrate,SB)的研究最为广泛。SB除了为结肠上皮细胞提供能量,还是最早发现的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。其调节能量摄入和利用,参与体重的控制。还通过影响肿瘤细胞的增殖和凋亡以及自噬在癌症中起着重要的作用。骨质疏松较常发生于髋部、股骨和腰椎,与骨组织的重建是密不可分的,是老年人致残甚至是致死的主要原因之一。骨质疏松中骨重建的不平衡,破骨细胞的形成和功能增加使得骨吸收大于骨形成。肠道菌群与骨骼健康之间存在着复杂而又紧密的联系。SB因其组蛋白去乙酰化酶抑制剂的作用影响骨重建,可以提高骨涎蛋白的以及骨保护素水平来刺激骨的形成,还能通过提高成骨细胞中骨桥蛋白的表达在早期抑制破骨细胞的分化。巨噬细胞是一种十分重要的免疫细胞,在人体各组织器官中均广泛存在,破骨细胞由血系单核/巨噬细胞分化而成。RAW264.7是来源于小鼠的单核/巨噬细胞株,广泛应用于巨噬细胞的研究。本实验探讨了不同浓度的SB对RAW264.7细胞自噬及破骨细胞分化的影响,CCK-8试剂盒检测SB处理后RAW264.7细胞的活性,Hoechst33342染色检测SB对RAW264.7细胞的细胞核的损伤,ROS及ATP试剂盒检测SB处理RAW264.7细胞后ROS以及ATP表达水平的作用,设计引物检测SB处理细胞后促炎因子的表达,Cyto-ID试剂盒检测SB对RAW264.7细胞自噬体的作用,蛋白质免疫印迹法检测相关蛋白的表达。实验中使用了荧光酶标仪、荧光显微镜、PCR仪以及流式细胞仪等检测实验结果。数据显示,SB剂量依赖性的影响细胞活性,0.25 m M SB使细胞活性显著升高,1 m M及以上SB处理后细胞活性显著降低,并使细胞核碎裂。细胞内的ROS水平随着SB处理浓度的升高呈剂量依赖性的先升高后有下降趋势,2 m M时达到最高水平。ATP含量则随着SB浓度的升高而减少。蛋白质免疫印迹的结果显示,1 m M SB减少了雷帕霉素靶蛋白(m TOR)的磷酸化,激活了自噬相关蛋白Unc-51样激酶1(ULK1)以及Beclin-1,减少了线粒体分裂蛋白DRP1的磷酸化水平。随着SB处理浓度的升高,组蛋白H3(Histone H3)的乙酰化水平随之增加,细胞核内p65蛋白的含量减少,凋亡蛋白Bcl-2样蛋白4(Bax)以及被剪切的半胱天冬酶3(cleaved-caspase3)的表达增加。SB对巨噬细胞的研究之前主要集中在其炎症的抑制作用上,本实验也检测了炎症因子的表达,证明1 m M SB可以减少白介素-6以及白介素1βm RNA的表达,表明SB或许可以在肠道中抑制肠道巨噬细胞的激活。而对于血系巨噬细胞,SB或许可以抑制其释放促进破骨分化的生长因子,减少破骨细胞生成。本论文利用RANKL诱导RAW264.7细胞的融合使其分化成为成熟的破骨细胞后,研究1 m M SB对破骨细胞的分化和功能的影响以及骨架的变化。对诱导后的破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate Resistant Acid Phosphatase,TRAP)染色以及骨再吸收的分析、细胞骨架的荧光染色。结果显示,1 m M SB减少了破骨细胞的数量以及骨再吸收形成的瘢痕,使细胞骨架发生了改变,F-肌动蛋白环被破坏。我们猜测SB或许通过核因子κB(Nuclear Factor kappa-B,NF-κB)信号通路的抑制作用减少成熟的破骨细胞的数量,从而减少骨吸收区域。SB对NF-κB信号通路的抑制作用还引起了细胞的凋亡,前体细胞株的凋亡也是破骨细胞减少的原因。另外,SB诱导的自噬水平的升高并未对破骨细胞的分化起到积极的作用,自噬机制对破骨细胞的影响还有待进一步的研究。本实验的结果表明,肠道菌群的代谢产物之一SB可以影响巨噬细胞以及成熟的破骨细胞,说明肠道菌群不仅自身可以通过影响肠道免疫系统改变骨质,还可以利用其代谢产物影响骨细胞。肠道菌群及其代谢物与骨组织之间的紧密联系为预防以及治疗骨质疏松提供了新的思路。
【图文】：

凋亡,细胞活性,细胞的,抑制作用

Imager 600 显影。3.13 统计学分析用 GraphPad Prism 6.0、IBM SPSS 20.0 以及 Excel 进行统计学分析，每个实验重复 3 次，对实验结果进行因素方差分析。p<0.05 代表着这两组实验结果在统计学上存在显著性差异。4. 结果4.1 SB 剂量依赖性的抑制 RAW264.7 细胞的活性CCK-8 试剂盒检测不同浓度 SB（0-4 mM）作用 24 h 对 RAW264.7 细胞活性的影响，结果显示，，与对照组（0mM）相比，0.25mMSB 处理时细胞活性显著增加了（P<0.05），随着浓度的增加，从 1mM 开始 SB 对细胞的活性起明显的抑制作用，2 mM SB 对细胞的抑制作用达到了约 50%，结果均具有统计学意义（P<0.05）（图 2-1. a）。a. b.

细胞内,线粒体,突触传递,血管张力

图 2-2.SB 处理 RAW264.7 后细胞内 ROS 及 ATP 水平的变化。a.SB 剂量依赖性的诱导细胞内的 ROS 水平（n=3；*p < 0.05)。b. SB 损耗细胞内的 ATP（n=3；*p < 0.05)。Figure 2-2. The effect of SB on ROS and ATP levels in RAW264.7 cells. a. SB dose-dependentlyincrease the intracellular ROS levels (n=3; *p < 0.05). b. SB decreaseATPlevelin cells(n=3; *p < 0.05).4.3 SB 对 RAW264.7 细胞内 ATP 水平的影响没有 ATP，我们所理解的生命就不可能存在，甚至细菌也依赖于与人类相同的 ATP 分子。ATP 水平降低促进细胞释放色素 c，增加了细胞的凋亡概率。ATP作为参与血管张力，突触传递和细胞死亡的细胞外信号分子，细胞内 ATP 水平反映细胞活力，包括细胞存活，生长和形态。细胞内的大部分 ATP 是在线粒体中产生的，细胞核和线粒体中基因的相互协调影响了 ATP 的产生。使用 ATP 试剂盒检测不同浓度 SB（0-4 mM）处理 RAW264.7 细胞 24 h 对细胞内 ATP 水平的影响。结果与对照组（0 mM）相比，0.25 mM SB 处理后，ATP 水平略有升高，0.5mM-4mMSB 处理后 ATP 水平呈逐渐下降趋势，结果具
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R580

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