【摘要】：目的:盐酸益母草碱是一种提取自细叶益母草的盐酸盐水合物,根据之前的研究,盐酸益母草碱具有多种的药用价值,主要集中在妇产科疾病治疗方面以及最新的心脑血管系统疾病诊治方面。有实验初步证明盐酸益母草碱对原发性骨质疏松有缓解作用,相关机制是通过抑制破骨细胞的增殖与分化而实现,但盐酸益母草碱对成骨细胞的具体相关机制尚未开展研究。本研究首次通过多种体内与体外实验方法研究盐酸益母草碱对成骨细胞的作用,并探讨可能存在的相关机制。研究方法:1、8周龄的雌性C57BL/6小鼠,体重在19-22克之间,在中国医科大学附属盛京医院本溪实验中心SPF级动物饲养间进行饲养。适应性饲养一周后,将小鼠随机分为三组,每组均为6只,分别为假手术组,骨质疏松模型组,骨质疏松模型+盐酸益母草碱干预组。其中假手术组打开腹腔后,无任何其他操作仅将腹膜以及皮肤进行缝合。骨质疏松模型组与骨质疏松模型+盐酸益母草碱干预组小鼠,打开腹腔后将双侧卵巢用6-0线进行结扎摘除,而后进行腹膜及皮肤缝合。术后一周骨质疏松模型+盐酸益母草碱干预组给予腹腔注射盐酸益母草碱,剂量为15mg/Kg/d,假手术组与骨质疏松模型组仅给予相同量的生理盐水腹腔注射。干预8周后,进行骨密度检测后,进行取材,选取股骨远端与胫骨近端骨组织以及外周血进行检测。2、通过对股骨远端骨组织进行病理组织切片,用HE染色法检测股骨远端干骺端骨小梁的大体结构,并对组织切片进行免疫组织化学检测,分别检测成骨分化蛋白Runx2以及Wnt/β-catenin通路下游蛋白β-catenin的体内骨骼组织中的表达情况。3、采用X线以及micro-CT方法检测小鼠骨密度以及骨微结构的改变情况。4、应用ELISA方法以及专用试剂盒,对采集的小鼠外周血进行骨钙素以及碱性磷酸酶的检测。5、利用CCK-8比色法检测盐酸益母草碱在体外对小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1的细胞活力影响作用。6、采用碱性磷酸酶染色以及茜素红染色检测盐酸益母草碱对小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1分化以及矿化的作用。7、运用实时荧光定量PCR技术检测盐酸益母草碱对体外小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1的影响作用,主要指标包括Wnt/β-catenin通路一些关键蛋白(LRP5、GSK-3β、β-catenin)的mRNA表达情况,以及成骨细胞分化(ALP、Runx2、Osterix、Col1-α1)和骨成熟蛋白(OPG)的相关重要mRNA表达情况。8、运用蛋白免疫印迹法(Western blot法)检测成骨细胞分化蛋白Runx2以及Wnt/β-catenin通路下游β-catenin以及磷酸化GSK-3β的蛋白表达情况。结果:1、骨质疏松造模组骨密度较正常对照组骨密度显著降低(P0.01),骨质疏松造模组+盐酸益母草碱较单纯骨质疏松造模组骨密度显著提升(P0.01)。2、与假手术组相比,骨质疏松造模组小鼠血清中骨钙素(OCN)显著降低(P0.01);较单纯骨质疏松造模组,骨质疏松造模+盐酸益母草碱组小鼠血清中骨钙素有所提升(P0.01)。与此相似的结果,骨质疏松造模组小鼠血清中碱性磷酸酶(ALP)水平较假手术组与骨质疏松造模+盐酸益母草碱组都明显降低(P0.01),盐酸益母草碱可以明显提升骨质疏松小鼠体内碱性磷酸酶的表达(P0.01)。3、HE染色发现原发性骨质疏松小鼠股骨远端骨小梁数量与宽度明显减少,间隔明显加大。盐酸益母草碱干预后可以使骨小梁稀疏程度明显改善。4、免疫组织化学检测显示,与假手术组比较,骨质疏松造模组β-catenin与Runx2股骨远端骨骼组织病理切片中表达显著降低(P0.01)。但骨质疏松造模+盐酸益母草碱组较骨质疏松组β-catenin与Runx2明显表达增多(P0.01)。5、Micro-CT检测胫骨近端骨微结构显示,与假手术组相比,骨质疏松模型组在骨小梁与总体积百分比(P0.01)、骨小梁面积与骨小梁体积百分比(P0.01)、骨小梁的宽度(P0.05)与数量上均明显下降(P0.01),骨小梁的间隔宽度显著上升(P0.01);而骨质疏松模型+盐酸益母草碱组,较骨质疏松造模组比较,盐酸益母草碱干预后显著提升了骨小梁体积百分比与骨小梁的数量(P0.01),降低了骨小梁的间隔(P0.05)。6、通过CCK-8检测盐酸益母草碱对体外小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1的活力影响,显示100μmmol/L以下浓度的盐酸益母草碱对MC3T3-E1细胞的增殖没有明显影响,100μmmol/L浓度,造成MC3T3-E1增殖速度明显下降(P0.01)。7、碱性磷酸酶以及茜素红染色显示,盐酸益母草碱(浓度为10μmmol/L,1μmmol/L)可以明显促进体外MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶分泌及钙化结节的产生。同时对MC3T3-E1细胞干预盐酸益母草碱1天与5天后的碱性磷酸酶浓度进行检测,显示干预1天各组之间碱性磷酸酶浓度并无明显差异,干预5天后10μmmol/L,1μmmol/L的益母草碱干预组碱性磷酸酶表达量显著提升,统计学差异分别为(P0.01,P0.05)。8、RT-PCR检测显示给予体外MC3T3-E1细胞盐酸益母草碱干预后,浓度为10μmmol/L的益母草碱干预组Wnt通路中相关重要节点基因LRP5、β-catenin的mRNA表达量显著上升,不同浓度的益母草碱(浓度为10μmmol/L,1μmmol/L,0.1μmmol/L)干预后,有提示成骨分化的基因(ALP、unx2、Osterix、Col1-α1)不同程度地表达升高,而显示骨成熟的基因OPG(骨保护素)不同浓度的益母草碱干预后表达亦表达升高。9、与假手术组相比,给予盐酸益母草碱干预后,MC3T3-E1细胞系表达Wnt通路下游关键蛋白β-catenin以及磷酸化的p-GSK-3β明显升高(10μmmol/L,1μmmol/L,P0.01),总GSK-3β表达无明显差异。成骨分化重要蛋白Runx2表达显著升高(10μmmol/L,1μmmol/L,0.1μmmol/L,P0.05)。结论:1、盐酸益母草碱可以显著提高原发性骨质疏松小鼠的骨密度值。2、盐酸益母草碱可以明显增加原发性骨质疏松小鼠干骺端附近骨小梁的数量以及减少骨小梁的平均间距,改善骨微结构,从而达到增加骨密度的作用。3、盐酸益母草碱可以显著提升原发性骨质疏松小鼠血清中表达的骨钙素水平以及碱性磷酸酶的表达。4、盐酸益母草碱可以在小鼠体内骨骼中增加Wnt/β-catenin通路下游蛋白β-catenin的表达以及成骨转录因子Runx2的表达,使成骨分化活动增加。5、盐酸益母草碱可以在体外成骨细胞系中激活Wnt/β-catenin信号通路,上调LRP5、β-catenin蛋白和其mRNA的表达水平,同时提高GSK-3β的磷酸化水平以及比例。6、盐酸益母草碱可以在体外提高成骨细胞系的MC3T3-E1的碱性磷酸酶活性及表达,促进成骨细胞的矿化过程。7、盐酸益母草碱可以上调成骨细胞分化的相关基因(ALP、Runx2、osterix、Col1-α1)和成熟相关基因OPG的mRNA表达。
【图文】：
麻醉下给予雌性8周龄C57BL/6小鼠进行双侧卵巢切除术
8图 2，，HE 染色显示各组小鼠股骨远端干骺端附近骨小梁结构。A 图为假手术组，B 图为骨质疏松组，C 图为骨质疏松+盐酸益母草碱组。淡粉色结缔组织为骨小梁。（光镜下 200X）
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R580
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