内质网应激及其介导的自噬流异常在氟致神经毒性中的作用

发布时间：2020-05-16 23:39

【摘要】：第一部分内质网应激与自噬在氟致SD大鼠神经毒性中的作用目的:过量氟暴露可产生神经毒性,然而其具体机制仍不清楚。本研究旨在探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)与自噬在氟致SD大鼠神经毒性中的作用,从而为阐明氟神经毒性机制提供基础依据。方法:40只SPF级Sprague-Dewley(SD)大鼠(180~220 g),随机分为4组:对照组(水氟含量1 mg/L)以及水氟含量为10、50、100 mg/L氟化钠(sodium fluoride,NaF)组,每组10只。各组大鼠通过自由饮水方式进行染毒,每天观察其进食、饮水等一般情况,并记录体重。染毒2个月后,通过Morris水迷宫实验检测各组大鼠的学习及记忆能力;尼氏染色观察大鼠海马组织病理改变;电子透射显微镜观察大鼠海马组织超微结构;Western blot检测大鼠海马及皮层组织ERS及凋亡的关键蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、需肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)、含半胱氨酸的天冬氨酸酶-12(cysteine containing aspartate specific protease-12,Caspase-12)、含半胱氨酸的天冬氨酸酶-3(cysteine containing aspartate specific protease-3,Caspase-3)以及自噬关键蛋白选择性自噬接头蛋白P62/sequestosome 1、自噬体形成相关蛋白Beclin1及微管相关蛋白轻链3-β(microtubule-associated protein 1 light chain3-β,LC3)的蛋白表达水平;免疫组化检测大鼠海马及皮层中GRP78、Caspase-12及LC3的定位表达情况。结果:在Morris水迷宫定位航行实验中,与同时间点对照组相比,100 mg/L NaF组大鼠游泳路程显著增加(P0.05),且100 mg/L NaF组大鼠较对照组大鼠找到平台的平均潜伏期显著延长(P0.05);在空间探索实验中,100 mg/L NaF组大鼠穿越原平台所在位置的次数明显少于对照组(P0.05);此外,50和100mg/L NaF组大鼠在原平台所在象限的活动时间(路径)与总时间(总路径)比值均明显低于对照组(P0.05)。尼氏染色结果显示,对照组大鼠海马组织CA3区神经元内尼氏小体数量丰富,而随着NaF剂量的增加,海马CA3区神经元内尼氏小体数量明显减少。电子透射显微镜显示对照组海马神经元核大,以常染色质为主,而NaF组可见核皱缩,边界不规则,染色质浓集,并出现大量自噬小体及肿胀的内质网。Western blot结果显示,与对照组相比,50及100 mg/L NaF组大鼠海马中GRP78蛋白表达水平均显著升高(P0.05),而各NaF组大鼠皮层中GRP78的蛋白表达水平均显著升高(P0.05);各NaF组大鼠海马中IRE1α的蛋白表达水平显著升高(P0.05),而50及100 mg/L NaF组大鼠皮层中IRE1α的蛋白表达水平显著升高(P0.05);此外,各NaF组大鼠海马中Cleaved caspase-12的蛋白表达水平显著升高(P0.05),而50及100 mg/L NaF组大鼠皮层中Cleaved caspase-12的蛋白表达水平显著升高(P0.05);各NaF组大鼠海马及皮层中Cleaved caspase-3的蛋白表达水平显著升高(P0.05)。与对照组相比,50及100mg/L NaF组大鼠海马中自噬关键蛋白Beclin1、P62及LC3-(40)(40)蛋白表达水平显著升高(P0.05);50及100 mg/L NaF组大鼠皮层中Beclin1以及各NaF组大鼠皮层的P62及LC3-(40)(40)蛋白表达水平显著升高(P0.05)。免疫组化结果显示,随着NaF剂量的增加,大鼠海马及皮层GRP78、Caspase-12及LC3蛋白的阳性细胞数均多于对照组,且随着NaF剂量的增加,上述蛋白的阳性细胞数增多。结论:氟暴露可致SD大鼠神经系统损伤,损害大鼠学习记忆能力。此外,氟暴露可引起SD大鼠海马及皮层发生ERS,并激活ERS介导的凋亡通路。同时,氟暴露还可促进SD大鼠海马及皮层自噬体形成,但抑制自噬体降解,因此导致了SD大鼠海马及皮层自噬流异常。综上所述,ERS及自噬参与了氟致SD大鼠神经系统的损伤过程。第二部分ERS及其介导的自噬在氟致SH-SY5Y细胞毒性中的作用目的:研究ERS及其介导的自噬在氟致人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞毒性中的作用,为探索氟致神经毒性机制提供线索。方法:SH-SY5Y细胞暴露于不同浓度NaF(0、10、20及30 mg/L),通过Western blot技术检测ERS及凋亡的关键蛋白GRP78、IRE1α、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)、Caspase-3,以及自噬关键蛋白Beclin1、P62及LC3的蛋白表达水平。ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-Phenylbutyric acid,4-PBA)、自噬抑制剂渥曼青霉素(Wortmannin,Wort)、氯喹(chloroquine,CQ)或自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)提前处理细胞1 h后,NaF染毒24 h,然后通过Western blot技术检测ERS及凋亡的关键蛋白GRP78、IRE1α、CHOP、Caspase-3,以及自噬关键蛋白Beclin1、P62及LC3的蛋白表达水平,采用免疫荧光技术检测各组LC3荧光斑点聚集,并通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测各组细胞存活率。结果:Western blot结果显示,与对照组相比,30 mg/L NaF组中细胞中GRP78、IRE1α、Cleaved caspase-3、Beclin1及LC3-(40)(40)的蛋白表达水平显著升高(P0.05),而20及30 mg/L NaF组细胞中CHOP及P62的蛋白表达水平显著升高(P0.05)。4-PBA干预NaF染毒SH-SY5Y细胞后发现,与NaF组相比,4-PBA+NaF组细胞中IRE1α、CHOP、Cleaved caspase-3、P62及LC3-(40)(40)蛋白表达水平显著降低(P0.05)。用自噬抑制剂干预后发现,与NaF组比较,Wort+NaF组细胞中P62及LC3-(40)(40)蛋白表达水平显著降低(P0.05),而CQ则进一步加剧因NaF暴露而导致的P62及LC3-(40)(40)蛋白表达的升高(P0.05);自噬激动剂Rapa干预NaF染毒SH-SY5Y细胞后发现,与NaF组比较,Rapa+NaF组细胞中P62蛋白表达水平显著降低,而LC3-(40)(40)蛋白表达水平显著升高(P0.05)。免疫荧光发现各组LC3荧光斑点聚集情况与各组LC3蛋白表达水平相一致。CCK-8法检测上述各种干预后细胞存活率发现,4-PBA干预可显著升高NaF组细胞存活率(P0.05),此外,自噬干预剂Wort,CQ干预可显著降低但Rapa干预可显著升高NaF组细胞存活率(P0.05)。结论:一定剂量NaF可致SH-SY5Y细胞发生ERS及自噬流受损,抑制自噬致细胞存活率降低,而激活自噬可促进细胞存活。此外,NaF引起的SH-SY5Y细胞ERS介导了自噬流受损的发生,抑制ERS可提高细胞存活率。
【图文】：

体重,系数,肝脏系数,露时

华中科技大学博士学位论文露对大鼠体重和脏器系数的影响露时间延长及染毒剂量增加，50 及 100 mg/L NaF 组大鼠照组相比无显著差异（P 0.05，见图 1-1）；此外，与对照组大鼠卵巢系数及甲状腺系数显著升高（P < 0.05，见表 1-肝脏系数及肾脏系数与对照组相比均无统计学差异（P 0

轨迹图,学习记忆能力,对照组,路程

华中科技大学博士学位论文33大鼠逃避潜伏期显著高于对照组（P < 0.05，图1-2B）；此外，在PNT期间，同一天内100 mg/L NaF组大鼠较对照组大鼠游泳路程显著增加（P < 0.05，图1-2C），训练第四天游泳轨迹见图1-2D。图1-2 氟对大鼠学习记忆能力的影响（n=10）注：（A）游泳速度；（B）逃避潜伏期；（C）游泳路程；（D）游泳轨迹图；100mg/L NaF组与对照组比较，，#P < 0.05；同时间点，100 mg/L NaF组与对照组比较，*P < 0.05。2.2.2 氟暴露对大鼠记忆保持能力的影响在SPT中
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R599.1

【参考文献】