不同浓度葡萄糖水平对SD大鼠CCSMCs自噬及表型的影响

发布时间：2020-05-17 01:58

【摘要】：背景:随着近年来糖尿病(Diabetes melitus,DM)发病率的升高,糖尿病性勃起功能障碍(Diabetes melitus induced Erectile dysfunction,DED)患者逐步成为一个庞大的群体,在男性性功能障碍性疾病中占有着相当大的比例。但基于DM对机体损伤机制的复杂性,以及DED发病机制与普通勃起功能障碍发病机制的差异性。DED的发病机制始终未能完全阐明。在众多关于勃起功能障碍(Erectile dysfunction,ED)发生、发展机制的研究中,阴茎海绵体平滑肌细胞(Corpus cavernosum smooth muscle cells,CCSMCs)方面的探索起步相对较晚,却展示出广阔前景,可能为ED的诊治带来新思路。CCSMCs是阴茎海绵体最主要的组成成分,也是阴茎勃起过程中各种神经-血管信号分子最终作用靶点,对阴茎海绵体微结构的维持至关重要。DED患者CCSMCs功能、形态、数量方面发生的改变也得以证实,但其机制目前尚不完全清楚。细胞自噬作为机体内重要的清除代谢产物、促进细胞适应外界刺激的机制,已经在多个领域内被证实与机体器官结构重塑相关。在心血管方面,有大量研究认为糖尿病机体血管平滑肌微结构的改变与细胞自噬的参与有关,并且这种改变源自于自噬对血管平滑肌细胞(Vascular smooth musle cells,VSMCs)表型的调控。糖尿病机体CCSMCs中自噬现象已被证实,但其对于CCSMCs的作用及机制,目前研究的尚不够深入。糖尿病诱导的CCSMCs自噬,是否具有同糖尿病机体VSMCs自噬相似的作用及作用机制,值得进一步证实,这可能为糖尿病性勃起功能障碍发病机制的探索提供新思路。目的:研究不同浓度葡萄糖水平对SD大鼠CCSMCs自噬水平及表型相关指标的影响,并初步探索二者之间的联系。方法:(1)检测不同浓度葡萄糖水平处理后CCSMCs自噬水平的变化:原代取材并培养CCSMCs,分别给予含25 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L葡萄糖、45 mmol/L葡萄糖的培养基处理细胞24 h。电镜观察自噬小体及自噬溶酶体,mFRP-GFP-LC3腺病毒转染观察各组自噬流情况,免疫荧光检测LC3表达,Western blot检测自噬相关蛋白LC3、P62、Beclin1表达;(2)探讨不同浓度葡萄糖水平对CCSMCs表型相关指标的影响:对CCSMCs分别给予上述3个浓度水平的葡萄糖处理细胞24 h,利用免疫荧光、Western blot检测CCSMCs表型相关蛋白α-SMA、hlcalponin、OPN表达,使用CCK-8试剂盒检测各组细胞的增殖能力,划痕实验检测其迁移能力;(3)探讨不同浓度葡萄糖水平诱导的CCSMCs自噬与表型转换的关系:根据前述处理后自噬及表型相关指标的变化,对所设置的几个葡萄糖浓度组中,自噬及表型转换现象均最明显的30 mmol/L葡萄糖组,分别给予自噬抑制剂羟氯喹及3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)进行处理。使用Western blot及mFRP-GFP-LC3腺病毒转染检测各组细胞自噬相关指标的表达,Western blot检测各组细胞平滑肌表型相关指标的表达。结果:(1)CCSMCs原代分离成功,电镜、m FRP-GFP-LC3腺病毒转染、免疫荧光、Western blot检测结果均提示,不同浓度葡萄糖处理后各组细胞均可见不同程度自噬现象;给予高于常规培养浓度(25 mmol/L)的葡萄糖处理CCSMCs后,自噬水平升高,且30 mmol/L组最强(P0.05),45 mmol/L组回降(P0.05)。(2)给予高于常规培养浓度(25 mmol/L)的葡萄糖处理后,免疫荧光及Western blot均提示葡萄糖浓度为30 mmol/L、45 mmol/L时收缩型平滑肌标志蛋白α-SMA、hlcalponin表达量较25 mmol/L时减少(P0.05),合成型平滑肌标志蛋白OPN的表达较25 mmol/L时增多(P0.05),CCSMCs增殖能力(P0.05)、迁移能力亦有所增强;且这些改变在30 mmol/L葡萄糖组均比45 mmol/L葡萄糖组更为明显(P0.05)。(3)给予Hydroxychloroquine、3-MA处理后,mFRP-GFP-LC3腺病毒转染及Western blot均提示自噬流受阻;同时,Western blot结果提示给予两种不同自噬抑制剂后,收缩型平滑肌标志蛋白α-SMA、hlcalponin表达量较30 mmol/L葡萄糖组有所回升(P0.05),合成型平滑肌标志蛋白OPN的表达较30 mmol/L时降低(P0.05),即CCSMC中葡萄糖诱导的表型转换受到了抑制。结论:(1)常规培养条件下自噬存在于CCSMCs中,当给予更高浓度葡萄糖干预后自噬可进一步增强,但葡萄糖水平超过某一临界值后自噬水平开始减弱;(2)葡萄糖浓度水平超过常规培养条件的葡萄糖浓度的后CCSMC发生表型转换,且随葡萄糖浓度变化的趋势与细胞自噬水平随葡萄糖浓度变化的趋势一致;(3)抑制细胞自噬,葡萄糖诱导CCSMCs表型转换受到抑制,说明葡萄糖诱导的CCSMC自噬可能参与了表型转换过程。
【图文】：

免疫荧光,光镜,形态,细胞

1.2 结果1.2.1 形态学及免疫荧光鉴定原代培养的 CCSMCs细胞经原代取材传代后(P3)光镜下观察形态，低倍显微镜下可见细胞束状排列，，呈现峰-谷样生长；高倍显微镜下可见绝大多数细胞呈现平滑肌细胞特有的梭形或纺锤状（图 1.1A）。免疫荧光结果提示α-SMA、hlcalponin 均呈现强阳性表达（图 1.1B）。CCSMCs 原代培养成功。

葡萄糖,定量分析,自噬,细胞

12图 1.2：免疫荧光检测各组细胞 LC3Ⅱ的聚集A：免疫荧光检测 LC3 表达;B:免疫荧光检测 LC3 的定量分析;与 25 mmol/L 葡萄糖组相比,##P＜0.01;与 30 mmol/L 葡萄糖组相比,ΔΔP＜0.01;n=5。1.2.3 电镜观察不同浓度葡萄糖处理后细胞内自噬小体及自噬溶酶体的形成不同浓度葡萄糖处理 CCSMCs 后，无论常规培养条件下还是给予超过常规培养浓度的葡萄糖，均有自噬小体及自噬溶酶体形成。但 30 mmol/L 葡萄糖组、45mmol/L 葡萄糖组自噬小体及自噬溶酶体总数均高于 25 mmol/L 葡萄糖组（P＜0.01），且 45 mmol/L 葡萄糖组较 30 mmol/L 葡萄糖组降低（P＜0.01）（图 1.3）。
【学位授予单位】：湖北医药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.1

【参考文献】