内皮祖细胞与脐静脉内皮细胞外泌体miRNA表达谱差异及miRNA-221-3p对糖尿病小鼠皮肤伤口愈合的促进作用研究

发布时间：2020-05-20 00:48

【摘要】：背景糖尿病皮肤溃疡是糖尿病患者由于神经血管病变导致微循环障碍而发生的溃疡和坏疽,往往迁延难愈,使患者预期寿命及生活质量显著下降。然而,糖尿病伤口愈合延迟或缺乏愈合的原因仍不清楚,并且可加速或促进其修复的治疗方法仍然有限。内皮细胞在血管生成中起重要作用,在血管生成时,血管内皮细胞被快速激活并迁移到远处位点进行增殖,从现有毛细血管形成新的初级毛细血管以促进组织修复,内皮功能障碍是糖尿病微血管和大血管并发症的基础。外泌体和mi RNA是参与糖尿病发病机制的重要分子,这些分子可以通过靶向参与糖尿病发病不同阶段的细胞和分子途径来发挥其作用。已经有研究报道,内皮祖细胞分泌的外泌体对血管内皮损伤的修复作用,但其具体分子机制仍未阐明。目的(1)探究内皮祖细胞外泌体和人脐静脉内皮细胞外泌体mi RNA表达谱及差异。(2)明确内皮祖细胞外泌体对糖尿病皮肤损伤的修复作用。(3)探究内皮祖细胞外泌体中包含的mi RNA-221-3p对糖尿病皮肤损伤的修复作用和机制。方法(1)细胞免疫荧光实验将诱导成的内皮祖细胞孵育CD133、Fl K-1抗体,然后孵育二抗,用荧光显微镜观察免疫荧光情况。(2)内皮祖细胞外泌体和脐静脉细胞外泌体mi RNA高通量测序分别从原代培养的内皮祖细胞和脐静脉细胞提取的外泌体,进行mi RNA建库和上机测序后,将原始数据过滤后使用相应软件进行定性和定量。(3)细胞划痕实验将胸主动脉内皮细胞使用mi RNA-221-3p转染处理后12小时在显微镜下进行观察和拍摄,观察细胞的运动及迁移能力改变。(4)免疫组化实验将对照组和实验组小鼠处死,取伤口愈合处真皮层皮肤组织进行免疫组化,观察真皮层CD31、Ki67、VEGF和PCNA表达量的改变情况。结果(1)免疫荧光实验结果显示,两个标志性蛋白CD133和Fl K-1皆呈阳性,显示内皮祖细胞被诱导分化成功。(2)通过人脐静脉内皮细胞和内皮祖细胞外泌体mi RNA高通量测序结果显示,内皮祖细胞外泌体与人脐静脉内皮细胞外泌体在mi RNA表达谱上有明显差异,并通过差异靶基因的功能和信号通路分析,显示出内皮祖细胞外泌体mi RNA的主要功能。(3)通过构建小鼠皮肤损伤模型,涂抹内皮祖细胞外泌体或mi RNA-221-3p观察皮肤愈合情况,发现外泌体和mi RNA-221-3p都可以促进正常小鼠和糖尿病小鼠伤口愈合。(4)免疫组化结果显示,内皮祖外泌体和mi RNA-221-3p孵育后的糖尿病皮肤损伤模型的皮肤处CD31、Ki67、VEGF和PCNA显著增加,并且新生血管增多。(5)细胞划痕实验结果显示,mi RNA-221-3p可以显著增强胸主动脉内皮细胞的迁移能力。结论(1)内皮祖细胞外泌体和mi RNA-221-3p可以促进糖尿病小鼠伤口愈合,并且导致CD31,Ki67、VEGF和PCNA蛋白表达增加,新生血管生成增加。(2)mi RNA-221-3p可以促进胸主动脉内皮细胞迁移能力。
【图文】：

免疫荧光,安徽医科大学,脐静脉内皮细胞,硕士学位论文

安徽医科大学硕士学位论文20行免疫荧光实验鉴定，结果如图1所示。结果显示CD133呈阳性，FlK-1也呈强阳性，这说明小鼠原代内皮祖细胞被成功的诱导分化。图1：原代培养的内皮祖细胞FlK-1、CD133免疫荧光鉴定（×200）Fig 1. The FlK-1 and CD133 of the differentiated endothelial progenitor cells werestrongly positive（×200）3.2 内皮祖细胞和脐静脉细胞外泌体 miRNAs 高通量测序数据的初步分析结果我们一共检测 8 个样本，包括四个内皮祖细胞和四个脐静脉内皮细胞外泌体miRNA 。编号分别是 EPCs-Exo1 ， EPCs-Exo2 ， EPCs-Exo3 ， EPCs-Exo4 ，HUVCEs-Exo1

质量图,碱基,数据质量,质量合格

TypeEPCs-Exo 1EPCs-Exo 2EPCs-Exo 3EPCs-Exo4HUVCEs-Exo1HUVCEs-Exo2HUVCEs-Exo3HUVCEs-Exo4Total_reads 13006725 1405817814232291 16826016 13475955 12925316 12849858 14576043Clean_reads 12394166 1353231213777508 16287231 12842966 12441322 12278390 13798049Size 304 M 334 M 331 M 379 M 317 M 304 M 304 M 340 M% 95.74% 96.63% 97.18% 97.17% 95.75% 96.70% 96.07% 95.16%表 1：Raw data 过滤结果Tab1. Filtered data3.3 内皮祖细胞和脐静脉内皮细胞外泌体 miRNAs 数据的质检报告为了判断过滤后数据是否属于高质量数据，我们通过常用的质量检测软件FastQC 对 Clean data 进行数据质量检控。并且使用 Multiqc（v.1.6）软件进行整合，结果如图 4 所示，我们发现所有的碱基质量都位于 Q30 之上，这说明我们获得了高质量的 reads，并且完全可以用于下一步的分析。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.1

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