利拉鲁肽调节高糖诱导的内皮集落形成细胞衰老对创面血管形成的影响及机制

发布时间：2020-05-24 18:16

【摘要】：研究背景及目的皮肤创面是糖尿病严重且常见的并发症,难以愈合的下肢溃疡更是患者截肢的重要原因。已有研究表明血管新生障碍是糖尿病创面难以愈合的关键因素。而内皮集落形成细胞(ECFCs)由于其克隆性增殖能力,可分化为成熟的内皮细胞并在体内外促进血管形成而备受关注。但在糖尿病环境下,ECFCs显示出数量减少及功能障碍。本小组前期研究发现高糖可诱导ECFCs衰老并下调Sirt7表达。同时,国外学者采用喜树碱诱导HEK293FT细胞衰老,发现核仁磷酸蛋白1(NPM1)的乙酰化水平随着Sirt7水平的降低而增加。最近的研究表明利拉鲁肽可以显著降低糖尿病患者足溃疡相关截肢的风险。为此,本文选择ECFCs为研究对象,以Sirt7为切入点:1.首先探索利拉鲁肽适宜干预浓度,然后构建裸鼠伤口模型并进行ECFCs移植,以探讨高糖及利拉鲁肽干预对创面愈合及血管形成的影响。2.体外模拟糖尿病环境,观察高糖诱导的ECFCs内的衰老标记蛋白30(SMP30)、核仁磷酸蛋白1(NPM1)乙酰化水平及p53蛋白的变化并进行利拉鲁肽的干预。3.通过转染过表达Sirt7慢病毒载体,以阐明Sirt7与SMP30、NPM1乙酰化水平、p53和ECFCs衰老的关系。研究方法采集健康成人外周血,通过密度梯度离心法分获得单个核细胞,于EGM-2全套培养基中进行诱导培养获得ECFCs。摸索利拉鲁肽最佳干预浓度后,将细胞随机分为三组:正糖组(NG)(5.5mmol/L D-葡萄糖),高糖组(HG)(30mmol/L D-葡萄糖),高糖干预组(HG+Lira)(30mmol/LD-葡萄糖+100nmol/L利拉鲁肽)。建立全层皮肤伤口模型后进行CM-Dil标记的ECFCs移植,观察创面愈合速度及毛细血管密度。体外模拟糖尿病环境,细胞随机分为三组:正糖组(NG)(5.5mmol/L D-葡萄糖),高糖组(HG)(30mmol/L D-葡萄糖),渗透压组(OSM)(5.5mmol/L D-葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇)。采用免疫印迹法检测SMP30,NPM1乙酰化,p53的表达。利拉鲁肽干预部分添加两组:正糖干预组(NG+Lira)(5.5mmol/L D-葡萄糖+100nmol/L利拉鲁肽),高糖干预组(HG+Lira)(30mmol/LD-葡萄糖+100nmol/L利拉鲁肽),检测SMP30,NPM1乙酰化,p53的表达。慢病毒载体上调Sirt7表达后,在高糖暴露的情况下检测过表达组以及空载体组的Sirt7,SMP30,NPM1乙酰化,p53的表达,上述所有分组干预时间均为6天。研究结果1.高糖情况下,利拉鲁肽的干预可上调Sirt7的表达,且在100nmol/L时,Sirt7表达水平上升至平台期。2.高糖组处理的ECFCs移植入小鼠体内后,小鼠的毛细血管密度减少,延迟创面愈合,而利拉鲁肽的干预可增加毛细血管密度,促进创面愈合。此外,在小鼠的血管结构处观察到移植前用CM-Dil标记呈红色的ECFCs,提示移植入的ECFCs掺入小鼠的脉管系统。3.高糖可增加ECFCs衰老,上调NPM1乙酰化水平及p53表达。利拉鲁肽干预及慢病毒上调Sirt7表达后,可减少ECFCs衰老,下调NPM1乙酰化水平及p53表达。结论高糖可诱导ECFCs衰老,导致创面血管形成减少,延迟创面愈合。其机制可能与高糖减少Sirt7表达,从而增加NPM1乙酰化水平,上调p53,促进ECFCs衰老有关。而给予利拉鲁肽后,通过上调Sirt7,逆转上述通路的发生,从而减少高糖诱导的ECFCs衰老,增加血管形成,促进创面愈合。
【图文】：

重庆医科大学硕士研究生学位论文采用单因素方差分析，组间进一步两两分析采用 Turkey 法T 检验，设检验水准α=0.05，p＜0.05 为差异具有统计学意义鲁肽浓度梯度实验前期工作发现，高糖显著下调 Sirt7 表达。在高糖（30mmol/利拉鲁肽（0-125nmol/L）共培养 6 天后，采用 Western bl图 1 可见，Sirt7 的表达随着利拉鲁肽干预浓度的升高，也 0nmol/L 组相比，其表达在 50nmol/L、75nmol/L、100nmol/L（p<0.05），且在 100nmol/L 达到平台期，因此，干预浓。

重庆医科大学硕士研究生学位论文点小鼠伤口的愈合情况如图 2A 所示，在第 3,5 和 7 天，高糖组的创面愈合速度明显低于正糖组的速度（P <0.05）。此外，对第 14 天收获的伤口组织切片进行 CD31染色以测量毛细血管密度。如图 2B 所示，同样地，高糖组的毛细血管密度显着低于正糖组。以上结果说明经高糖干预的 ECFCs 可减少小鼠体内的血管形成。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2

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本文编号：2678791