P物质在糖尿病大鼠胰腺内的变化及其对胰岛细胞物质分泌的影响

发布时间：2020-05-25 17:23

【摘要】：糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种以持续的高血糖为基本特征的慢性全身性代谢疾病,是由于多种病因引起的胰岛素抵抗或胰岛素分泌绝对或相对不足而引起血糖升高的代谢紊乱性疾病。胰岛素是胰腺β细胞合成的一种调节血糖的激素,除了降低血糖外,胰岛素还可以抑制胰高血糖素的分泌。SP是速激肽家族的一员,是一个11个氨基酸的肽。SP可以直接发挥作用或与神经激肽1(NK-1)受体结合后发挥其作用。SP也被发现作为中枢神经系统的痛觉敏感神经递质,作为外周组织的损伤信使和免疫调节剂。有研究表明,非肥胖糖尿病(NOD)小鼠注射SP后,胰岛素抵抗,慢性炎症胰岛细胞和糖尿病症状被逆转。GLP-1是一种主要由L细胞分泌的肽类物质,GLP-1在促进胰岛素的合成和分泌中起重要作用,它可以抑制β细胞凋亡,提高细胞的增殖和再生,减少胰高血糖素的分泌,延缓胃排空,减少食物的摄入,促进外周组织和减少肝糖输出,增加对葡萄糖的利用。GLP-1发挥降血糖作用是在较高血糖水平下,而在正常情况下则不起作用。这种葡萄糖浓度依赖的降糖特点显著减少了在降糖过程中低血糖情况的发生,是一种新型安全有效的降糖方式。因此,寻找一种安全有效的提高GLP-1浓度的方法显得尤为重要。在本研究中,我们研究了SP在大鼠胰岛团中的潜在功能。研究表明,SP作用于胰腺神经系统与胰岛α细胞的NK-1受体上。SP可能是治疗糖尿病的一种很有前途的治疗策略。实验材料及方法:第一部分:糖尿病大鼠胰腺内P物质的含量变化及其意义健康SD大鼠,体重200-250 g,高脂高糖喂养后注射STZ建立二型糖尿病大鼠模型。乌拉坦麻醉后分离胰腺,显微解剖其胰腺神经节,免疫荧光双染PGP9.5和SP(Substance P)。比较正常组和糖尿病组胰腺神经节内SP表达的变化。western blot和ELISA检测正常组和糖尿病组胰腺内SP蛋白表达的变化。第二部分:P物质对胰岛调控的研究分离纯化大鼠胰岛团,通过FDA/PI双染来选出最优的SP处理浓度后进行细胞培养。将其放入24孔板中培养,分成4组:空白对照组、SP培养组、L-703,606处理组和L-703,606处理2小时后SP培养组,每孔20-30个胰岛团。用ELISA试剂盒来检测胰岛团胰岛素,GLP-1及胰高血糖素的分泌情况。并制作冰冻切片进行NK-1R及α细胞免疫荧光染色。结果:第一部分:糖尿病大鼠胰腺内P物质的含量变化及其意义糖尿病大鼠胰腺神经节神经元中SP阳性表达的占21.3%±1.7%,与正常大鼠性比较(34.0%±1.2%,n=13)有减少(p0.05)。糖尿病组SP表达为76.7±11.6%(n=5),对照组SP表达为103±10.7%(n=5),差异有统计学意义(P0.05)。糖尿病组SP含量为1903.3±125.2 pg/ml(n=5),正常组SP含量为2989.72±101.3 pg/ml(n=5),差异有统计学意义(P0.05)。第二部分:P物质对胰岛调控的研究胰岛团分别用含有SP与不含有SP的培养基培养三天后,收集上清进行Elisa检测。加入SP培养后,SP处理组胰岛素释放量(3.6±0.2μIU/IEQ,n=5,p0.05)与空白组(2.8±0.3μIU/IEQ,n=5,)比较显著升高,GLP-1分泌量(6.3±0.4 pM/IEQ,n=5,p0.05)与空白组(4.3±0.3 pM/IEQ,n=5)比较明显增加,胰高血糖素分泌量(31.2±9.4 pM/IEQ,n=5,p0.05)与空白组(43.9±11.7 pM/IEQ,n=5)略有减少,但两组间差异没有统计学意义。在加入SP受体NK-1R抑制剂L-703,606后,胰岛素释放量(2.6±0.1μIU/IEQ,n=5,p0.05)与SP组(3.6±0.2μIU/IEQ,n=5,)比较显著减少,GLP-1分泌量(4.2±0.5 pM/IEQ,n=5,p0.05)与SP组(6.3±0.4 pM/IEQ,n=5)比较明显减少,胰高血糖素分泌量(22.8±6.4 pM/IEQ,n=5,p0.05)与SP组(31.2±9.3 pM/IEQ,n=5)相比略有减少,但两组间差异没有统计学意义。在SP条件下与低糖(2.7Mm)培养环境相比(2.6±0.7 pM/IEQ,n=3),高糖(16.7 Mm)条件下GLP-1分泌量(11.7±2.1 pM/IEQ,n=3,p0.05)明显增加,且24小时之内分泌量随着时间的延长增加。免疫荧光结果显示胰腺神经系统与胰岛有着密切的联系,且在胰岛α细胞上由NK-1受体的表达。结论:在糖尿病病理状态下,胰腺与胰腺神经节中的SP表达均减少。在胰岛细胞中,SP对胰岛细胞有保护作用且可以促进其胰岛素的分泌,可能的机制是通过作用于α细胞的NK-1受体促进GLP-1的分泌导致。
【图文】：

糖尿病大鼠胰腺神经节神经元 SP 的表达（×200）。绿色荧光为 PGP9.5，标记所有神经元，红色荧光为 SP，白色箭头所指为胰腺神经节神经元。3.2 正常大鼠与糖尿病大鼠胰腺内 SP 蛋白表达用 western blot 分析两组大鼠胰腺内 SP 的蛋白表达异同。糖尿病大鼠胰腺内SP 和正常大鼠比较有显著的降低，结果显示见图 2。通过光密度值计算，糖尿病组 SP 表达为 76.7±11.6% (n=5)，对照组 SP 表达为 103±10.7% (n=5)，差异有统计学意义（P<0.05），结果显示见图 3。

. 糖尿病大鼠与正常大鼠胰腺内 SP 的表达蛋白灰度值比较。#：p<0.05 (n大鼠与糖尿病大鼠胰腺内 SP 含量ISA 法定量分析两组大鼠胰腺内 SP 的蛋白含量变化，，结果显示见胰腺内 SP 和正常组比较有显著的降低，糖尿病大鼠胰腺内 SP5.2 pg/ml(n=5)，正常大鼠胰腺内 SP 含量为 2989.72±101.3 pg/ml学意义（P<0.05）。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.1

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