脊髓背角HCN4通道对糖尿病神经痛作用的研究

发布时间：2020-05-25 16:16

【摘要】：糖尿病神经痛(diabetic neuropathic pain,DNP)是糖尿病常见的慢性并发症,对患者的生活质量造成严重影响。脊髓是躯体感觉信息整合的关键部位,研究显示表达于脊髓背角的超极化激活环核苷酸门控(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated,HCN)通道及钾氯联合转运蛋白2(K~+-Cl~-cotransporter 2,KCC2)参与了病理性疼痛的发生、发展。其中,HCN4通道大量表达于背角胶状质抑制性中间神经元,KCC2亦高表达于脊髓胶状质神经元,糖尿病神经痛时HCN4通道激活所诱发的K~+外流是否调节KCC2功能,继而影响背角抑制性中间神经元γ-氨基丁酸(GABA)的释放及痛敏,均有待阐明。本课题通过制作大鼠糖尿病神经性疼痛模型,观察:1)脊髓背角HCN4通道在糖尿病神经痛中的作用;2)KCC2是否参与HCN4通道对糖尿病神经痛大鼠的镇痛作用。本课题探讨脊髓背角HCN4通道在糖尿病神经痛发生中的作用及机制,为开发以HCN4通道为靶点的新型镇痛药提供理论基础。目的:1.观察脊髓背角HCN4通道在糖尿病神经痛中的作用。2.观察KCC2是否参与HCN4通道对糖尿病神经痛大鼠的镇痛作用。方法:1.4~5周龄SD大鼠随机分为3组(n=12):(1)对照组;(2)STZ组(鞘内给予生理盐水);(3)ZD7288+STZ组(鞘内给予HCN通道拮抗剂ZD7288)。单次腹腔注射60 mg/kg链脲佐菌素(STZ)制备大鼠糖尿病模型,注射STZ 2 w后鞘内给予HCN通道拮抗剂ZD7288。分别于造模前及造模后14、21、28 d测定大鼠空腹血糖和体重;行为学检测机械缩足阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)及热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL);免疫印迹技术检测大鼠脊髓背角HCN4通道、谷氨酸脱羧酶65(glutamate decarboxylase 65,GAD65)及KCC2蛋白的表达;邻苯二甲醛柱前衍生高效液相色谱法检测大鼠脊髓背角GABA含量。2.4~5周龄SD大鼠随机分为5组(n=12):(1)对照组;(2)STZ组(鞘内给予生理盐水);(3)ZD7288+STZ组(鞘内给予HCN通道拮抗剂ZD7288);(4)DIOA+STZ组(鞘内给予KCC2抑制剂DIOA);(5)DIOA+ZD7288+STZ组(先鞘内给予DIOA,10 min后再给予ZD7288)。单次腹腔注射60 mg/kg STZ制备大鼠糖尿病模型,注射STZ 2 w后鞘内给予HCN通道拮抗剂ZD7288及KCC2抑制剂DIOA。测定各组大鼠MWT及TWL值,免疫印迹技术检测大鼠脊髓背角HCN4通道蛋白的表达。结果:1.与对照组相比,糖尿病大鼠体重明显减轻(P0.01),空腹血糖值明显升高(P0.01),鞘内注射HCN通道拮抗剂ZD7288对糖尿病大鼠体重和空腹血糖无显著影响(P0.05);大鼠腹腔注射STZ 2 w后MWT、TWL明显缩短,产生糖尿病神经痛,鞘内给予ZD7288可显著延长糖尿病大鼠的MWT、TWL(P0.01);糖尿病大鼠脊髓背角HCN4通道蛋白表达显著增高(P0.01)、KCC2蛋白表达降低(P0.01)、GAD65表达无显著变化(P0.05),鞘内注射HCN通道拮抗剂ZD7288可显著降低糖尿病大鼠脊髓背角HCN4表达、升高KCC2表达(P0.01);糖尿病大鼠脊髓背角GABA含量显著增加(P0.05),鞘内给予ZD7288可显著降低背角GABA含量(P0.05)。2.鞘内给予KCC2抑制剂DIOA可显著降低糖尿病大鼠的MWT、TWL,促进DNP的发生、发展(P0.01)。此外,预先鞘内给予KCC2抑制剂DIOA可显著抑制HCN通道拮抗剂ZD7288的镇痛效应(P0.01),并且可显著升高糖尿病大鼠脊髓背角HCN4通道的表达(P0.01)。结论:1.脊髓背角HCN4通道表达增加促进了糖尿病神经痛的发生、发展。2.HCN4通道在糖尿病神经痛中的作用可能与其抑制糖尿病大鼠脊髓背角神经元KCC2表达所致的“GABA向兴奋性转化”密切相关。
【图文】：

图1 HPLC色谱图A.空白液；B.GABA对照品；C.组织样品液（1为GABA峰）Fig.1 The HPLC chromatogramA. Blank solution; B. GABA reference substance; C. Tissue sample solution（5）标准曲线的制备精密吸取GABA对照品储备液，加入三蒸水稀释成GABA终质量浓度分别为10、15、25、50、100 μg/mL的系列溶液，衍生化处理后按“1.2.7（1）”项色谱条件分别进样检测，以GABA的峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x）为横坐标绘制标准曲线，得标准曲线y = 13.166x + 3.5073（r=0.9997），见图 2。表明GABA在10 ~ 100 μg/mL范围内与峰面积线性良好。

图1 HPLC色谱图白液；B.GABA对照品；C.组织样品液（1为GABA峰Fig.1 The HPLC chromatogramsolution; B. GABA reference substance; C. Tissue sampl备对照品储备液，加入三蒸水稀释成GABA终质/mL的系列溶液，衍生化处理后按“1.2.7（1）的峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x）为横坐6x + 3.5073（r=0.9997），见图 2。表明GABA良好。
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2

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本文编号：2680410