TNF-α调控Semaphorin Ⅲ家族蛋白参与绝经后骨质疏松发生的机制研究

发布时间：2020-05-26 01:29

【摘要】：第一部分:绝经后骨质疏松疾病中TNF-α通过JNK信号途径上调Semaphorin3D蛋白表达诱导破骨细胞分化一、研究目的骨质疏松严重威胁中老年人健康,是全球性的公共卫生问题。女性绝经后诱导形成的骨质疏松症是目前研究最多,同时也是发病率最高的骨质疏松症类型。绝经后骨质疏松(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)是一种与雌激素缺乏直接相关,以全身性骨量减少及骨组织显微结构破坏为特征,导致骨脆性增加和易于骨折的代谢性骨病。然而迄今有关PMOP发病的确切机制尚未完全阐释。雌激素减少导致破骨细胞的过度活跃是PMOP发生的重要机制之一。伴随妇女更年期雌激素水平的下降,促进了T细胞及成骨细胞等产生刺激破骨细胞分化和活化的细胞因子。体内的雌激素主要是通过这些细胞因子等途径间接调节破骨细胞的形成。目前发现,在这些因子中TNF-α作为PMOP发生的核心因素,其对破骨细胞分化的正向调控是PMOP中破骨细胞分化增加的重要原因。由于TNF-α对破骨细胞调控方式的多样性和调控机制的复杂性,其确切的调控机制仍需进一步探索。目前,越来越多的研究证实SemaphorinsⅢ(Sema3)家族蛋白在骨代谢紊乱以及骨质疏松疾病中具有重要功能。基因敲除Sema3A的小鼠骨质明显的减少。1,25-二羟基维生素D3(1,25-(OH)2D3)能够上调成骨细胞中Sema3B的表达,从而间接促进破骨细胞的分化引起骨吸收增加。然而,目前尚不清楚SemaⅢ家族蛋白是否也参与了PMOP中TNF-α对破骨细胞分化的调节作用。本研究拟通过体内及体外实验,结合分子生物学技术,应用基因沉默及过表达等干预手段,筛选PMOP中参与TNF-α诱导破骨细胞分化的SemaⅢ家族蛋白;明确SemaⅢ家族蛋白在TNF-α促进破骨细胞分化中的作用;探索TNF-α通过SemaⅢ家族蛋白促进破骨细胞分化的作用。本研究的完成对于探索绝经后骨质疏松的发生机制、寻找新的治疗靶点提供重要的理论依据。二、研究方法1、培养正常小鼠来源的破骨细胞,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技术对破骨细胞形成的标志性基因(TRAP、c-Fos和NFATc-1)表达检测等方法,明确TNF-α对破骨细胞分化的影响。2、在TNF-α促进RANKL诱导破骨细胞分化的过程中,通过qRT-PCR技术检测SemaⅢ家族蛋白(Sema3A、Sema3B、Sema3C、Sema3D和Sema3E)表达量的变化,并进一步检测SemaⅢ家族蛋白受体(Plx-A1、Plx-A2、Plx-A3、Plx-A4、NPR1和NPR2)表达量的改变。3、构建假手术组(Sham operation,Sham)小鼠、去卵巢组(Ovariectomized,OVX)小鼠、OVX+PBS小鼠及OVX+TNF-α中和性抗体(anti-TNF-α)小鼠模型,通过酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)实验检测各组模型小鼠血清中TNF-α水平的变化,并通过微计算机断层扫描技术(micro computed tomography,micro-CT)技术确定模型构建是否成功。4、通过TRAP染色观察Sham组、OVX组、OVX+PBS组及OVX+anti-TNF-α组小鼠股骨干骺端的破骨细胞数量变化。5、分离各组模型小鼠股骨及胫骨骨髓源性巨噬细胞(Bone marrow macrophages cells,BMMs),体外诱导分化为成熟的破骨细胞,qRT-PCR及蛋白免疫印迹(Western blot)技术检测破骨细胞中Sema3D表达量的变化。6、应用Sema3D过表达及shRNA慢病毒载体感染破骨细胞前体细胞,通过TRAP染色及qRT-PCR检测破骨细胞形成的标志性基因(TRAP、c-Fos和NFATc-1)表达等方法,明确过表达/基因沉默Sema3D对细胞核因子κB受体活化因子(Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL)诱导的破骨细胞分化的影响,并进一步观察过表达/基因沉默Sema3D对TNF-α正向调控RANKL诱导破骨细胞分化的影响。7、通过CCK-8(Cell Counting Kit)活力测定实验、脱氧尿嘧啶核苷(EdU)荧光染色实验和CFSE荧光强度测定实验,观察过表达/基因沉默Sema3D对TNF-α诱导的破骨细胞前体细胞增殖的影响。8、通过Western Blot技术检测TNF-α对RANKL诱导破骨细胞分化的不同时间点中(5 min,15 min,30 min,60 min)p38、p65和JNK信号途径的影响。9、应用SB203580、BAY 11-7082、SP600125分别阻断p38、NF-κB以及JNK信号途径,通过qRT-PCR及Western blot技术检测TNF-α对Sema3D表达的影响。10、通过TRAP染色以及TRAP标志性基因的检测(TRAP,c-Fos和NFATc1),观察阻断JNK信号途径后过表达Sema3D对破骨细胞分化的影响。11、构建了壳聚糖包被siRNA-Sema3D的纳米颗粒,通过尾静脉注射OVX小鼠。应用micro-CT逐层扫描技术观察Sham组,OVX组,OVX+siRNA-Sema3D组及OVX+siRNA-NC组小鼠的骨组织形态学改变。三、结果1、TNF-α能够增加TRAP阳性染色的破骨细胞数量,并且够促进破骨细胞中TRAP,NFATc1和c-Fos基因的表达,提示TNF-α能够促进RANKL诱导的破骨细胞形成。进一步研究发现,TNF-α通过作用于破骨细胞分化的早期阶段促进破骨细胞的形成。2、在TNF-α正向调控破骨细胞形成过程中SemaⅢ家族蛋白中的sema3D表达量增加最明显,并且TNF-α诱导的sema3D表达量的增加存在时间依赖性。此外,我们发现TNF-α在促进破骨细胞分化的过程中SemaⅢ家族蛋白受体NPR1的表达量明显减少,而Plx-A3的表达量轻微的减少。3、过表达Sema3D后能够明显的促进RANKL诱导破骨细胞分化,而阻断Sema3D后RANKL诱导的破骨细胞分化明显减少。此外,过表达Sema3D后能够明显的促进TNF-α正向调控RANKL诱导的破骨细胞分化,而阻断Sema3D后能够缓解TNF-α诱导的破骨细胞分化,提示Sema3D在TNF-α诱导破骨细胞分化的过程中具有重要功能。4、TNF-α能够明显的促进破骨细胞前体细胞的增殖,而基因沉默Sema3D后能够明显缓解TNF-α诱导的破骨细胞前体细胞增殖,这些结果证明Sema3D介导了TNF-α对破骨细胞前体细胞增殖的调控。过表达或基因沉默Sema3D后并未影响细胞的凋亡。5、在TNF-α正向调控RANKL诱导破骨细胞分化的过程中p38、p65和JNK信号途径被进一步的激活。应用SP600125阻断JNK信号途径后,能够明显的缓解TNF-α对Sema3D表达的促进作用。阻断JNK信号途径能够明显的缓解TNF-α诱导的破骨细胞分化,而阻断JNK信号途径后过表达Sema3D能够促进破骨细胞的形成。6、阻断内源性Sema3D后能够明显减少OVX诱导的小鼠骨质疏松,并且降低了小鼠血清中骨吸收指标CTX-1的水平。四、结论1、TNF-α是导致绝经后骨质疏松中破骨细胞分化增加、骨吸收增强的重要因素。雌激素缺乏后导致TNF-α水平升高,过量的TNF-α能够促进RANKL诱导的破骨细胞分化,并且这种诱导作用发生在破骨细胞分化的早期阶段。2、在TNF-α促进RANKL诱导的破骨细胞分化过程中,Sema3D的表达量明显增加。Sema3D的增加一方面通过促进破骨细胞前体细胞的增殖增加破骨细胞的数量,另一方面通过促进RANKL诱导的破骨细胞分化影响破骨细胞的形成。3、TNF-α通过激活JNK途径上调了Sema3D的表达。体内抑制Sema3D能够有效缓解OVX诱导的小鼠骨质疏松。第二部分:绝经后骨质疏松中TNF-α通过抑制Wnt/β-catenin信号途径下调Semaphorin3B表达抑制成骨细胞分化一、研究目的骨质疏松严重威胁中老年人健康,是全球性的公共卫生问题。女性绝经后诱导形成的骨质疏松症是目前研究最多,同时也是发病率最高的骨质疏松症类型。在我国60岁以上的女性中,骨质疏松的患病率高达40%-50%,其中约30%-50%将经历骨质疏松相关的骨折,这严重地影响老年人的身体健康及生活质量,甚至缩短寿命。与绝经相关的骨质疏松症是不可忽视的重要保健课题,探索其确切的发病机制对于PMOP的防治具有重要意义。骨骼是一种时刻发生着动态衍变的器官,而保持其生物结构的整体性和稳定性均需要依赖于骨重塑这样一种动态调节过程。骨重构是一个旧骨吸收与新骨形成的动态调节过程。研究证实,在绝经后骨质疏松发病过程的早期,破骨活动加强,成骨也随之代偿性加强,但随着病程的进展,成骨活动受到抑制,从而导致成骨破骨的平衡被打破,引起骨量丧失。研究发现,妇女更年期雌激素水平的下降,引起了一些炎症因子水平的变化。在这些因子中TNF-α是PMOP发生的核心因素。成骨细胞是由MSCs分化而来,而TNF-α可以通过其受体TNFR1来抑制MSCs的成骨分化。TNF-α对MSCs成骨分化的抑制作用是PMOP中骨形成减少的重要原因。然而,TNF-α抑制MSCs向成骨细胞分化的确切机制尚未完全阐释。SemaⅢ家族蛋白在骨稳态的调节中具有重要作用。研究发现,Sema3A能够促进成骨细胞的分化抑制破骨细胞的形成。Sema3E能够抑制小鼠成骨细胞的迁移并抑制破骨细胞的形成。此外,成骨细胞特异性高表达Sema3B的转基因小鼠,骨矿化明显增强。尽管这些研究证实SemaⅢ家族蛋白与骨代谢密切相关,然而目前尚不清楚SemaⅢ家族蛋白是否也参与了PMOP中TNF-α抑制MSCs向成骨细胞的分化。本研究拟通过体内及体外实验,结合分子生物学技术,应用基因沉默及过表达等干预手段,筛选PMOP中参与TNF-α抑制BMMSCs向成骨细胞分化的SemaⅢ家族蛋白;明确SemaⅢ家族蛋白在TNF-α抑制BMMSCs向成骨细胞分化中的功能;探索TNF-α通过SemaⅢ家族蛋白抑制BMMSCs向成骨细胞分化的分子机制。本研究的完成有助于阐释PMOP的发病机制,尤其是TNF-α相关的骨形成减少的分子机制。二、研究方法1、培养正常小鼠骨髓来源的MSCs(BMMSCs)细胞,在TNF-α抑制BMSCs向成骨细胞分化的不同时间点(0天、3天、7天、14天),通过qRT-PCR技术检测SemaⅢ家族蛋白(Sema3A、Sema3B、Sema3C、Sema3D和Sema3E)表达量的变化,并通过Western blot技术进一步验证Sema3B在此过程中表达量的变化。2、构建Sham小鼠、OVX小鼠、OVX+PBS小鼠及OVX+anti-TNF-α小鼠模型,通过micro-CT技术确定模型构建是否成功,通过Elisa实验检测各组模型小鼠血清中TNF-α水平的变化,并通过免疫组化技术观察各组模型小鼠股骨干骺端TNF-α表达量的变化。3、构建TNF-α中和抗体抑制OVX诱导骨质疏松的小鼠模型,免疫组化技术观察各组模型小鼠股骨干骺端Sema3B表达量的变化,qRT-PCR技术检测SemaⅢ家族蛋白受体(Plx-A1、Plx-A2、Plx-A3、Plx-A4、NPR1和NPR2)表达量的变化。4、分离各组模型小鼠的BMMSCs,qRT-PCR技术检测细胞中Sema3B表达量的变化。5、分离各组模型小鼠的BMMSCs,体外成骨诱导分化培养不同的时间点(7天、14天),qRT-PCR技术、western blot技术检测细胞中Sema3B表达量的变化,Elisa实验检测细胞培养液中TNF-α含量的变化。6、应用Sema3B过表达及shRNA慢病毒载体感染BMMSCs细胞,通过ALP染色、ALP活力测定、茜素红染色以及成骨细胞标志性基因(Runx2,Osterix和Osteocalcin)检测等方法,明确过表达/基因沉默Sema3B对BMMSCs向成骨细胞分化的影响,并进一步观察过表达/基因沉默Sema3B对TNF-α抑制BMMSCs向成骨细胞分化的影响。7、通过CCK-8活力测定实验、EdU荧光染色实验和CFSE荧光强度测定实验,观察过表达/基因沉默Sema3B对TNF-α抑制的BMMSCs细胞增殖的影响。8、QRT-PCR技术检测TNF-α对BMMSCs细胞中Wnt/β-catenin信号途径的几个关键蛋白分子DKK-1,GSK-3β和β-catenin表达的影响。9、分别应用Licl(20 mM)和BIO(5μM)激活BMMSCs细胞中的Wnt/β-catenin信号途径,并给与10 ng/ml的TNF-α处理24 h。Western blot实验检测BMMSCs细胞中Sema3B表达量的变化。三、结果1、TNF-α在抑制BMMSCs向成骨细胞分化的过程中sema3A,sema3C,sema3D和sema3E的表达量并没有发生明显的变化,而sema3B的表达量明显的减少且具有时间依赖性。2、OVX组小梁骨密度(BMD)和静态微观结构参数(Tb.Th、BV/TV和Tb.N)明显小于Sham组,OVX+anti-TNF-α组小鼠骨量相对于OVX组小鼠明显增加。OVX组小鼠相对于Sham组小鼠小梁骨变细、数量减少,TNF-α中和抗体能够缓解OVX引起的小鼠股骨干骺端小梁骨结构的变化。3、OVX组小鼠TNF-α水平明显高于Sham组小鼠,而应用TNF-α中和抗体能够有效地降低OVX组小鼠的TNF-α水平;OVX组小鼠相对于Sham组小鼠股骨干骺端TNF-α的表达明显增加,而应用TNF-α中和抗体能够明显减少TNF-α表达。4、OVX组小鼠相对于Sham组小鼠股骨干骺端Sema3B的表达明显减少,而OVX小鼠应用TNF-α中和抗体后能够明显增加Sema3B的表达;相对于Sham组小鼠,OVX组小鼠来源的BMMSCs(OVX-MSCs)中Sema3B的表达量明显减少,而TNF-α中和抗体的应用能够明显的增加OVX小鼠BMMSCs中Sema3B的表达。5、各组模型小鼠的BMMSCs,即(Sham-MSCs,OVX-MSCs,OVX+anti-TNF-α-MSCs),通过体外成骨诱导分化培养7天和14天,结果显示相对于Sham-MSCs组,OVX-MSCs组中Sema3B的表达量明显减少,而OVX+anti-TNF-α-MSCs组相对于OVX-MSCs组Sema3B的表达明显增加;OVX-MSCs组相对于Sham-MSCs组细胞培养液上清中TNF-α的含量明显增加,而OVX+anti-TNF-α-MSCs组相对于OVX-MSCs组细胞培养液上清中TNF-α的含量明显减少。6、各组模型小鼠的BMMSCs细胞中,SemaⅢ家族蛋白受体NRP1,Plx-A1和Plx-A4表达量明显减少,而Plx-A3的表达量明显的增加。7、过表达Sema3B后能够明显的促进BMMSCs的成骨分化,而阻断Sema3B后BMMSCs的成骨分化明显减少;此外,过表达Sema3B后能够明显的缓解TNF-α抑制的BMMSCs向成骨细胞分化,而阻断Sema3D后能够促进TNF-α抑制的BMMSCs向成骨细胞分化。8、TNF-α能够明显的抑制BMMSCs细胞的增殖,而过表达Sema3B后能够明显缓解TNF-α对BMMSCs细胞增殖的抑制作用。9、TNF-α抑制BMMSCs向成骨细胞分化的过程中,DKK-1,GSK-3β和β-catenin的蛋白表达量明显降低,表明TNF-α能够明显的抑制BMMSCs细胞中Wnt/β-catenin信号途径。10、Wnt/β-catenin信号途径的激活能够明显的缓解TNF-α对BMMSCs细胞中Sema3B表达的抑制作用,提示TNF-α通过抑制Wnt/β-catenin信号途径负向调控Sema3B的表达。四、结论1、TNF-α是导致绝经后骨质疏松疾病中BMMSCs向成骨细胞分化抑制、骨形成减少的重要因素。在TNF-α抑制BMMSCs向成骨细胞分化过程中,Sema3B的表达量明显减少。Sema3B表达量的降低一方面通过影响BMMSCs的增殖来减少成骨细胞形成的数量,另一方面通过抑制BMMSCs细胞向成骨细胞分化影响骨形成。2、TNF-α抑制MSCs细胞向成骨细胞分化的过程中,DKK-1,GSK-3β和β-catenin的蛋白表达量明显降低,提示TNF-α能够明显的抑制MSCs细胞中Wnt/β-catenin信号途径。而Wnt/β-catenin信号途径的激活能够明显的缓解TNF-α对MSCs细胞中Sema3B表达的抑制作用,提示TNF-α通过抑制Wnt/β-catenin信号途径负向调控Sema3B的表达。
【图文】：

F-α对 RANKL-诱导的破骨细胞分化的影响。A-B:TRAP 染 RANKL 诱导的破骨细胞形成，n=6;** P<0.01；C-E: QRT-P骨细胞标志性基因(TRAP, NFATc1, c-Fos)表达的影响。n=3;*定 TNF-α是通过影响细胞分化的哪个阶段，，从而促进 RANKL我们分别在 RANKL 诱导破骨细胞分化的不同时间点（0 天，）加入 10 ng/ml 的 TNF-α,通过 TRAP 染色观察破骨细胞分化的NKL 诱导破骨细胞形成的早期阶段（1-2 天）给予 TNF-α的处显增加；然而在RANKL诱导破骨细胞形成的晚期阶段（3-4天骨细胞的形成并没有明显的改变。提示 TNF-α是通过作用在破，促进破骨细胞形成。

. TNF-α对 RANKL-诱导的破骨细胞分化的影响。A-B:TRAP 染色观促进 RANKL 诱导的破骨细胞形成，n=6;** P<0.01；C-E: QRT-PCR 技对破骨细胞标志性基因(TRAP, NFATc1, c-Fos)表达的影响。n=3;** P<了确定 TNF-α是通过影响细胞分化的哪个阶段，从而促进 RANKL 诱导成，我们分别在 RANKL 诱导破骨细胞分化的不同时间点（0 天，1 天4 天）加入 10 ng/ml 的 TNF-α,通过 TRAP 染色观察破骨细胞分化的改变 RANKL 诱导破骨细胞形成的早期阶段（1-2 天）给予 TNF-α的处理，化明显增加；然而在RANKL诱导破骨细胞形成的晚期阶段（3-4天）给予，破骨细胞的形成并没有明显的改变。提示 TNF-α是通过作用在破骨细阶段，促进破骨细胞形成。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R580

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本文编号：2681062