采用基于FRET的荧光生物传感器技术测定第二信使PKA在MIN6细胞胰岛素分泌中的作用及机制

发布时间：2020-05-27 21:43

【摘要】：目的:通过不同浓度葡萄糖和胰高血糖素(Glucagon,GC)处理MIN6细胞(胰岛β细胞系),并在添加蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)信号通路刺激剂异丙肾上腺素(Isoprenaline,ISO)前后检测PKA的变化及胰岛素的分泌,进一步探讨PKA在GC促进MIN6细胞胰岛素分泌中的作用。方法:1.体外培养小鼠MIN6细胞并每天换液,当细胞生长到一定密度后传代用于实验;2.将细胞分成三组,分别加入0mmol/L(无糖)、2.8mmol/L(低糖)和16.7mmol/L(高糖)三个葡萄糖浓度,在此基础上分别设置0ng/L、500ng/L和1000ng/L三个浓度水平的GC进行干预,将对PKA表达敏感的AKR质粒及空白质粒PCDNA3.1用电穿孔转染法分别转入MIN6细胞,利用融合了生物传感器的荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术在添加刺激剂ISO前后实时定量检测各组细胞内PKA的变化;3.酶联免疫吸附剂测定法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分别检测添加刺激剂ISO前后不同处理组的细胞上清液中胰岛素的分泌量;4.收集数据并进行统计分析。结果:1.基于FRET的生物传感器技术检测不同浓度葡萄糖环境下不同浓度GC干预对PKA的影响:(1)无糖时:500ng/L GC阶段较空白处理和0ng/L GC阶段显著上升,1000ng/L GC阶段较空白处理和0ng/L GC阶段显著上升,ISO阶段较各阶段均显著上升(P0.05);(2)低糖时:0ng/L GC阶段较空白处理阶段显著上升,500ng/L GC阶段较空白处理和0ng/L GC阶段显著上升,1000ng/L GC阶段较空白处理和0ng/L GC阶段显著上升,ISO阶段较各阶段均显著上升(P0.05);(3)高糖时:0ng/L GC阶段较空白处理阶段显著上升,500ng/L GC阶段较空白处理和0ng/L GC阶段显著上升,1000ng/L GC阶段较空白处理和0ng/L GC阶段显著上升,ISO阶段较各阶段均显著上升(P0.05);(4)不同浓度GC干预对PKA生成影响的比较:无糖组各浓度GC阶段之间无显著差异(P0.05),低糖组和高糖组1000ng/L GC阶段均显著高于500ng/L GC阶段(P0.05);2.ELISA检测不同浓度GC对各组细胞分泌胰岛素的影响:(1)无ISO时:无糖1组中,1000ng/L GC干预后高于500、0ng/L时,500ng/L GC干预后高于0ng/L时(P0.05)。低糖1组中,1000ng/L GC干预后高于500、0ng/L时,500ng/L GC高于0ng/L时(P0.05)。高糖1组中,1000ng/L GC干预后高于500、0ng/L时,500ng/L GC干预后高于0ng/L时(P0.05);(2)添加ISO后:无糖2组中,1000ng/L GC干预后高于500、0ng/L时,500ng/L GC干预后高于0ng/L时(P0.05)。低糖2组中,1000ng/L GC干预后高于500、0ng/L时,500ng/L GC干预后高于0ng/L时(P0.05)。高糖2组中,1000ng/L GC干预后高于500、0ng/L时,500ng/L GC干预后高于0ng/L时(P0.05);(3)添加ISO前后胰岛素分泌量差值的比较:无糖时,1000ng/L GC干预后高于0ng/L时(P0.05);低糖时,1000ng/L GC干预后高于0ng/L时,500ng/L GC干预后高于0ng/L时(P0.05);高糖时,1000ng/L GC干预后高于500、0ng/L时,500ng/L GC干预后高于0ng/L时(P0.05)。结论:1.GC以浓度递增的形式通过增加MIN6细胞内PKA的浓度来促进胰岛素分泌;2.添加刺激剂ISO后GC增加PKA及胰岛素分泌的作用更加明显,说明GC促进胰岛素分泌的作用通过第二信使信号系统PKA通路途径实现;3.GC通过增加PKA的浓度促进胰岛素分泌的作用具有一定的葡萄糖依赖性。
【图文】：

采用基于 FRET 的荧光生物传感器技术测定第二信使 PKA 在 MIN6 细胞胰岛素分泌中的作用及机制结 果(Results)1.MIN6 细胞在培养中的一般形态在倒置显微镜下观察 MIN6 细胞的形态，长梭形贴壁生长，图 1 所示为（放大倍数A 为 4×，B 为 10×，C 为 20×）第 6 代在培养的细胞。

采用基于 FRET 的荧光生物传感器技术测定第二信使 PKA 在 MIN6 细胞胰岛素分泌中的作用及机制图 2 转染后 MIN6 细胞荧光蛋白的表达Fig 2 Expression of Fluorescent Protein in Transfected MIN6 Cells在激光共聚焦显微镜下，定位单个细胞后用油镜观察，按照表 4 设置激发波长和发射波长范围后，开始采集荧光图像，，如图 3（放大倍数 20×）：A、B、C 分别为 CFP、YFP、FRET 现象的荧光图像。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.1;TP212.3

【参考文献】

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本文编号：2684182