绿原酸抗卵巢去势小鼠骨代谢作用的机制研究

发布时间：2020-05-30 07:56

【摘要】：引言骨质疏松(Osteoporosis,OP)是最为常见的一种骨代谢疾病,其特征为骨强度降低,骨组织显微结构退化,骨脆性增加,极大的增加了骨折风险。然而,目前对骨质疏松的发病机制尚不明确,各种药物起效的机制也待研究。因此阐明骨质疏松发病机制,寻找新的药物靶点是防治骨质疏松的关键科学问题。近期研究表明,p38MAPK通路是参与炎症反应调控的重要信号通路,其信号传导途径在间充质干细胞向成骨细胞的增殖分化中起着重要作用。p38MAPK通路激活后,成骨细胞的特异性因子Cbfa1表达增加。P38MAPK途径可控制多种转录因子的基因活性表达,如NF-κB、MAX、SAP-1、HSF-1等。其中,有些转录因子p38直接底物,而有些是间接底物。其机制尚不清楚。课题组前期研究表明,绿原酸可促进骨髓间质干细胞成骨及抑制其成脂肪分化。我们还发现绿原酸治疗骨质疏松模型大鼠后可增加BMSCs的成骨分化能力,增加成骨细胞的数量,提高骨质疏松模型大鼠骨密度和骨小梁数量。但目前对于绿原酸促进BMSCs成骨分化、增加成骨细胞数量与抑制骨质疏松的机制,尚不清楚。为了探究绿原酸的抗骨质疏松机制,本研究分为三部分。实验一:基因芯片谱分析寻找目标基因及基因发生作用的可能通路;实验二:离体实验验证目标基因的作用;实验三:在体实验验证目标基因的作用。实验一 基因芯片谱分析卵巢去势小鼠模型中绿原酸的抗骨质疏松作用机制背景骨质疏松症是一种临床较为常见的代谢性疾病,主要表现为骨量的丢失,骨小梁微结构的破坏。女性在绝经期后,由于体内雌性激素的缺乏,导致免疫系统激活,炎症因子慢性持续增高,成骨与破骨平衡打破。破骨活性高于成骨,最终造成骨质疏松的进一步加重。目前临床治疗骨质疏松药物主要是激素为主,它们都有一定的副作用,因此都在寻找替代药物。课题组一直致力于的研究。发现杜仲具有抗骨质疏松作用,且绿原酸是杜仲主要成分之一,课题组前期研究表明,绿原酸可促进骨髓间质干细胞成骨及抑制其成脂肪分化。我们还发现绿原酸治疗骨质疏松模型小鼠后可增加BMSCs的成骨分化能力,增加成骨细胞的数量,提高骨质疏松模型大鼠骨密度和骨小梁数量。但目前对于绿原酸促进BMSCs成骨分化、增加成骨细胞数量与抑制骨质疏松的机制,尚不清楚。本实验通过基因芯片谱分析绿原酸干预后卵巢去势小鼠模型中的差异基因并分析其抗骨代谢可能机制,为今后发展中药治疗绝经后骨质疏松症提供有效的临床依据。目的:通过基因芯片谱分析CGA干预后卵巢去势小鼠模型的基因变化及基因可能影响的信号通路。方法:(1)将30只BALB/c小鼠随机分为三组:假手术组(Sham组)、模型组(OVX组)、绿原酸干预组(OVXT组),每组10只。Sham组与OVX组给予生理盐水灌胃,OVXT组给予绿原酸45mg/kg.d。每天一次,连续10W。(2)10周脱颈处死小鼠,酒精浸泡消毒后完整取出小鼠双侧股骨及胫骨。(3)从胫骨中分离培养骨髓间充质干细胞(BMSCs)并鉴定。(4)股骨固定液固定后送Micro-CT检测骨小梁微观结构变化情况。(5)微阵列图谱鉴定骨髓间充质干细胞的基因表达并用q PCR验证。(6)KEGG分析及Wb法检测各组细胞内的各种激酶的的表达。(7)利用SPSS20.0软件对结果进行统计分析。结果:(1)流式细胞仪检测线显示:CD_(29)和CD_(44)为阳性;CD_(34)和CD_(45)为阴性。说明提取细胞为BMSCs细胞。(2)Micro-CT显示Sham组骨小梁数量最多,OVXT其次,OVX组最少。各项骨微小结构如:BV/TV,Tb.N,Tb.Th,BMD等指标三组两两之间比较均有差异(P0.05)。(3)通过微阵列图谱鉴定骨髓间充质干细胞的基因表达,有121个基因在OVX组和OVXT组间表达差异,其中36个基因表达显著(改变倍数2和P0.05)。而RGD1564664、Pdlim3、Myh11、Ear11和Nnat是表达差异最明显的五个基因,通过对36个基因用q PCR验证,Acss2、Cd24、Nnat和Pkp2四个基因的表达差异最显著。(4)KEGG和MAPK信号通路分析,Hspa1a、Fgfr2、Gadd45a、Tgfb3、Hspa1b等5个基因定位于MAPK通路。MARK通路的经典蛋白验证生物信息学结果,发现与OVX组相比,OVXT组ERK和p38磷酸化增加。结论:(1).CGA可以有效地对抗卵巢去势小鼠模骨质疏松,改善骨骼的骨密度。(2)Nnat可能在CGA抗骨质疏松中起作用。(3)CGA抗骨质疏松作用可能是通过激活MAPK通路达成的。实验二 Nnat对卵巢去势小鼠BMSCs成骨分化的影响及其机制的研究背景:研究表明,Nnat可激活NF-κB等炎症因子的表达,同时还可以诱导p38、Jun、AKT激酶磷酸化,而PI3K及p38抑制剂可阻止Nnat激活NF-κB除此之外,Nnat被认为可激活NF-κB、MAPK、FAK信号通路。由丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)介导的信号转导,包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38已被发现被认为对正常破骨细胞和成骨细胞的分化和活化至关重要。各种外源刺激(如toll样受体激动剂)和内源性刺激(如生长因子和炎症细胞因子)有助于确定MAPKs对破骨细胞和成骨细胞的黏附、迁移、融合和存活、以及破骨细胞骨吸收的影响25-28。我们在第一部分的研究中发现CGA有抗骨质疏松作用,与OVX组相比,OVXT组中的Nnat基因明显增高,同时ERK和p38磷酸化增加。我们推测Nnat在卵巢去势小鼠成骨分化中方面起作用。且其可能是通过激活与ERK和P38相关的MAPK促进成骨分化的。目的:探讨Nnat在卵巢去势小鼠BMSCs诱导成骨分化过程的作用及其机制方法:(1)取第四代BMSCs,用成骨细胞培养液进行成骨分化培养,分别于诱导成骨分化的第0、3、5、7、10、14天,用q PCR法检测细胞内Nnat的转录水平。(2)取第四代BMSCs分成普通培养组(NC组)、Nnat过表达(Nnat组)、空载质粒组(KZ组)和普通成骨培养(NC组)、Nnat敲低(si RAN组)、转入空载质粒组(KZ组)。(本实验Nnat过表达及敲低非同步进行)。(3)利用q PCR法检测各组细胞内Runx2 m RNA的转录水平。(4)利用PNPP法分析各组细胞中ALP的活力情况。(5)茜素红染色测细胞矿化结节评价细胞成骨能力。(6)利用Wb法检测各组细胞内的各种激酶的的表达。(7)统计分析采用SPSS20.0软件和image J软件进行。结果:(1)随着BMSCs成骨分化诱导时间的推移,细胞内Nnat表达逐步增强,有统计学意义。(2)q PCR检测各组的细胞的Runx-2 m RNA表达水平显示:与普通诱导成骨组(NC组)相比,Nnat过表达后(Nnat组)Runx-2 m RNA表达明显升高,用si RNA敲低Nnat后(si RNA组),Runx-2 m RNA表达明显下降,且差异具有统计学意义(p0.05)。空载对照组(KZ)与相应普通培养组(NC组),Runx-2 m RNA表达无明显差异;与对应的的实验组比较,Runx-2 m RNA表达有明显差异,差异具有统计学意义(p0.05)。(3)PNPP法检测各组BMSCs经诱导成骨后细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性显示:与对照组(NC组)相比,Nnat过表达后(Nnat组),ALP活力明显升高,用si RNA敲低Nnat后(si RNA组),ALP活力明显下降,且差异具有统计学意义(p0.05)。(4)茜素红染色检测各组BMSCs经诱导成骨后细胞内矿化结节数显示:与对照组(NC组)相比,Nnat过表达后(Nnat组),矿化结节数量明显增多,用si RNA敲低Nnat后(si RNA组),矿化结节数量明显减少,且差异具有统计学意义(p0.05)。(5)利用WB法检测各组细胞内的各种激酶的的表达显示:与对照组(NC组)相比,Nnat组ERK1/2、JNK、p38、c-Fos以及c-Jun的表达明显增高,si RNA组ERK1/2、ERK5、p38以及c-Jun的表达明显减低,差异具有统计学意义(p0.05)。结论:1.Nnat能够调控卵巢去势小鼠BMSCs的成骨分化。Nnat表达增高,促进成骨分化,Nnat表达降低,抑制成骨分化。2.Nnat调控BMSCs诱导成骨分化是通过MAKP信号通路实现的。实验三 Nnat对卵巢去势小鼠模型骨代谢的影响研究背景动物实验是人类直接认识生命现象的重要媒介,它对于人们认识有机界各种规律的作用是无可争辩和无可取代的。医学动物实验是实现科学研究从分子细胞水平到临床研究的重要纽带。上一部分实验发现,Nnat能过调控OVX小鼠BMSCs诱导成骨分化。为了明确Nnat在在体中的作用,我们进行动物实验研究。目的:探讨Nnat对卵巢去势小鼠骨代谢的影响。方法:(1)将70只BALB/c小鼠按体重随机分成7组。A组:假手术组(Sham组);B组:模型组(OVX组);C组:OVX+Nnat过表达组:D组:OVX+空载质粒组;E组:OVX+CGA组;F组:OVX+CGA+Nnat过表达组;G组:OVX+CGA+空载质粒组,每组各10只。各组小鼠的初始平均体重差异无统计学意义(P0.05)(2)由手术当天及术后第5周从鼠尾静脉注入分别注入相应的干预液体:C组和F组注入过表达Nnat病毒(10ul/次/只);D组和G组注入空载质粒(10ul/次/只);A组、B组和E组注入生理盐水((10ul/次/只)。(3)术后第二天开始,E、F、G组用绿原酸溶液灌胃(45 mg/kg/天),A、B、C、D用换算成同等量的0.9%氯化钠注射液灌胃,自由饮水,摄食。每天观察小鼠各种情况,每周测量一次体重。(4)10周脱颈处死小鼠,酒精浸泡消毒后完整取出小鼠双侧股骨及胫骨(5)从股骨中分离培养骨髓间充质干细胞(BMSCs),用q PCR检查Nnat的表达。(6)胫骨micro-CT检测骨小梁微观结构变化。(7)利用SPSS20.0软件对结果进行统计分析。结果:(1)micro-CT扫描显示:与Sham组比较,所有组卵巢去势小鼠胫骨干骺端骨小梁数量显著减少,OVX组和OVC+KZ组减少最多;与OVX组相比:OVX+Nnat组、OVX+CGA组、OVX+CGA+Nnat组及OVX+CGA+KZ组的骨小梁数有所增加,其中OVX+CGA+Nnat组增加更明显,但与Sham组仍有差异。OVX组与OVX+KZ组骨小梁数差别不明显,OVX+CGA组与OVX+CGA+KZ组骨小梁数差别不明显。(2)对micro-CT扫描细微结构参数(BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th)分析显示:Sham组最高,与其余各组都有明显差异,差异具有统计学意义(p0.05);OVX组和OVC+KZ组最低;与OVX组相比,OVX+Nnat组、OVX+CGA组、OVX+CGA+Nnat组及OVX+CGA+KZ组值明显升高,其中OVX+CGA+Nnat组增加更明显,差别具有统计学意义(p0.05)。OVX组与OVX+KZ组之间差别不明显,OVX+CGA组与OVX+CGA+KZ组之间差别不明显。(3)q PCR检测Nnat表达显示:与OVX组相比,OVX+KZ组无明显差异,差异无统计学意义,OVX+Nnat组、OVX+CGA组、OVX+CGA+Nnat组及OVX+CGA+KZ组值明显升高,其中OVX+CGA+Nnat组增加更明显,差别具有统计学意义(p0.05);与OVX+CGA组相比,OVX+CGA+KZ组无明显差异,差异无统计学意义,OVX+CGA+Nnat组Nnat表达明显增高,差异有统计学意义(p0.05)。结论:(1)Nnat表达增强能够改善卵巢去势小鼠的骨结构,提高卵巢去势小鼠胫骨的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th值。(2)绿原酸能上调卵巢去势小鼠内体的Nnat表达,进而提高卵巢去势小鼠胫骨的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th值。
【图文】：

3.结果3.1 BMSCs 原代、传代培养通过倒置显微镜观察显示：初始时原代 BMSCs 培养皿内杂质较多，表现大小不一，梭形形态不明显。接种 4-6h 后 BMSCs 基本贴壁，24h 后可见贴壁细胞呈现梭形、多边形等多种形态，其中以长梭形细胞为主；4-5 天后，BMSCs 细胞形成散在集落，细胞膜清晰，细胞体透亮，胞浆丰富，，核仁清晰，细胞突起突长变大，细胞开始增殖；7-9 天左右细胞数量明显增多，贴壁细胞形态趋于一致呈长梭形。细胞集落增殖扩大相互靠近并融合成片汇合至 85-95%，细胞与细胞间相互紧密贴合，呈簇状或漩涡状同向生长排列。进行细胞传代，传代后细胞生长速度明显增快，代谢旺盛，以 1:3 的比例接种 3-4 天后，其可增殖至 80%－90%，即可进入下一次传代扩增。（见图 2.1）

图 2.2 流式细胞仪测细胞的表面抗原3.3 通过 micro-CT 分析各组股骨各项指标的差异3.3.1 绿原酸改善卵巢去势小鼠股骨干骺端骨微结构从 Micro-CT 三维重建图可以看出，与 Sham 组比较，OVX 组小鼠股骨干骺端骨小梁数量显著减少；经绿原酸干预后的小鼠（OVXT 组）股骨干骺端的骨小梁数量增加，但与 Sham 组比较仍有差异。（见图 2.3）3.3.2 绿原酸增加卵巢去势小鼠的 BMD 值小鼠在去除卵巢后，由于缺乏雌激素，导致骨量减少，表现为 OVX 组小鼠的 BMD 值显著低于 Sham 组小鼠，差异有统计学意义（P < 0.01）；在给去卵巢小鼠口服绿原酸后，骨丢失减少，表现为 OVXT 组小鼠的 BMD 值高于 OVX 组小鼠，差异有统计学意义（P < 0.05）（图 2.4），且与 Sham 组相比也存在一定的差异，差异有统计学意义（P < 0.05），结果表明绿原酸可以提高 BMD 值，
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R580

【参考文献】

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1 周萍;李R

本文编号：2687832