TIPE2负向调控mTORC1促进哮喘巨噬细胞M2极化的效应及其机制研究

发布时间：2020-05-30 14:06

【摘要】：研究背景:支气管哮喘(哮喘)是儿童最常见的慢性呼吸道疾病,反复发作会严重影响儿童的健康和生活质量。近30年来我国城市儿童哮喘患病率呈显著上升趋势。哮喘是一种以气道高反应性、炎症细胞浸润、黏液过度产生和气道重塑为特征的慢性炎症性疾病,可由呼吸道感染、变应原暴露、剧烈运动、气候变化等诱发,吸入糖皮质激素是治疗哮喘的经典药物,部分患儿治疗效果不好。约有5%～10%的哮喘患者即使接受高剂量的吸入糖皮质激素治疗甚至加用全身使用的糖皮质激素,哮喘仍然反复发作,严重时会危及生命,不仅影响生活质量,对医疗支出也有重大影响。因此,阐明哮喘的免疫调控机制具有重要意义,可为研发治疗哮喘的新方法提供新的候选靶分子。哮喘发病机制非常复杂,对哮喘发病机制的研究在过去几年中取得了较多进展,当前认为Thl/Th2平衡失调所致Th2优势是哮喘发病机制之一。Th2细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)4、IL-13在哮喘发病中起重要作用。近几年研究发现,巨噬细胞极化与哮喘关系密切。巨噬细胞极化是指巨噬细胞在体内微环境刺激下转化成一种特定的表型并出现特定功能的过程。巨噬细胞有两种主要表型,即经典激活或M1型巨噬细胞和选择性激活或M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞有促炎作用,由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)单独或与Th1细胞因子如干扰素γ(Interferon γ,IFN-γ)联合诱导极化,产生促炎细胞因子如白介素-1β(Interleukin 1β,IL-1β),IL-6,IL-12,IL-23和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α);M2型巨噬细胞有抗炎和免疫调节作用,有四个亚群M2a,M2b,M2c和M2d。巨噬细胞M2a亚群由IL-4和IL-13诱导,产生抗炎细胞因子IL-10及转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)。M1/M2极化状态可通过复杂和相互作用的内源性细胞信号通路及其调节因子被快速诱导并完全逆转或复极化。IL-4可通过JAK/STAT与PI3K/Akt信号通路诱导巨噬细胞M2极化,参与哮喘的调控,因此,阐明IL-4诱导的巨噬细胞M2极化的免疫调控机制,可为治疗哮喘的新方法提供新的思路。肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2(tumor necrosis factor-α-induced protein 8-like 2,TIPE2)是肿瘤坏死因子α诱导蛋白8(tumor necrosis factor-α-induced protein 8,TNFAIP8)家族成员之一,最早在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型中发现的,TIPE2主要表达于胸腺、淋巴结、脾脏及小肠粘膜等,在巨噬细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞等免疫细胞中高表达,在免疫反应中发挥重要的负向调节作用。TIPE2参与多条信号通路的调控,如JNK、NF-kB等。研究发现TIPE2在系统性红斑狼疮、慢性乙肝病毒感染及哮喘中表达均有改变。TIPE2在系统性红斑狼疮患者中表达下调,有研究发现TIPE2可以通过诱导M2型巨噬细胞极化减轻系统性红斑狼疮。哮喘儿童外周血单核细胞TIPE2下调,而TIPE2是否参与哮喘的调控目前并不清楚。由于巨噬细胞M2极化与哮喘关系密切,因此我们将研究TIPE2对巨噬细胞M2极化的调控效应及机制,为今后进一步研究TIPE2在哮喘中的作用提供理论依据。在本项研究中,我们通过动物实验明确卵清蛋白诱导的哮喘小鼠肺巨噬细胞极化状态的改变及肺组织IL-4表达的改变。通过细胞实验研究TIPE2对巨噬细胞极化的调控效应,并探讨TIPE2调控IL-4诱导的巨噬细胞M2极化的分子机制。本项研究将为今后探索TIPE2调控哮喘的效应及机制提供理论依据。第一部分卵清蛋白诱导的哮喘小鼠肺巨噬细胞极化状态的研究目的:1.研究卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)诱导的哮喘小鼠肺巨噬细胞极化状态的改变。2.研究OVA诱导的哮喘小鼠肺组织中细胞因子IL-4的改变。方法:1.用OVA诱导建立哮喘小鼠模型。2.用RT-qPCR法检测哮喘小鼠与对照小鼠肺组织中的IL-4。3.用RT-qPCR法检测哮喘小鼠与对照小鼠肺组织中M1极化标志(iNOS)、M1极化基因(CD38)及M2极化基因(Arg-1)的表达。结果:1.OVA诱导的哮喘小鼠与对照组小鼠相比,肺组织中IL-4明显升高。2.OVA诱导的哮喘小鼠与对照组小鼠相比,M2极化基因(Arg-1)的表达明显升高,而M1极化标志物(iNOS)、M1极化基因(CD38)的表达没有明显差异。结论:OVA诱导的哮喘小鼠肺组织中IL-4升高,M2极化基因表达上调。第二部分TIPE2调控巨噬细胞极化的效应目的:在本研究中,我们在体外细胞水平检测巨噬细胞M1及M2极化时TIPE2表达的改变,并通过将TIPE2沉默或过表达研究TIPE2对巨噬细胞极化的调控效应。方法:1.以骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDMs)为研究对象,用 LPS/IFN-y 和 IL-4 分别刺激 BMDMs,用 RT-qPCR 及 Western-blot 法检测TIPE2,以明确巨噬细胞M1和M2极化时TIPE2表达的变化。2.用shRNA将BMDMs的TIPE2沉默,用LPS/IFN-γ诱导其M1极化,用ELISA检测M1极化细胞因子(TNF-α、IL-6)、用RT-qPCR检测M1极化相关基因,用IL-4诱导其M2极化,用ELISA检测M2极化细胞因子IL-10、用RT-qPCR检测M2极化相关基因,研究TIPE2沉默对巨噬细胞M1极化和M2极化的影响。3.将BMDMs的TIPE2过表达,用LPS/IFN-y诱导其M1极化,用ELISA检测M1极化细胞因子(TNF-α、IL-6)、用RT-qPCR检测M1极化相关基因,用IL-4诱导其M2极化,用ELISA检测M2极化细胞因子IL-10、用RT-qPCR检测M2极化相关基因,研究TIPE2过表达对巨噬细胞M1极化和M2极化的影响。结果:1.LPS/IFN-γ诱导BMDMs进行M1极化,TIPE2表达下调。IL-4诱导BMDMs进行M2极化,TIPE2表达上调。2.TIPE2沉默的BMDMs,在LPS/IFN-y诱导M1极化后,与对照组BMDMs相比,M1极化细胞因子(TNF-α、IL-6)及M1极化相关基因(CD38、FPR2、GPR18)表达上调;在IL-4诱导M2极化后,与对照组BMDMs相比,M2极化细胞因子 IL-10 及 M2 极化相关基因(EGR2、MGL1、MGL2、FIZZ1、YM1、MRC1、PGC1β)表达下调。3.TIPE2过表达的BMDMs,在LPS/IFN-γ诱导M1极化后,与对照组BMDMs相比,M1极化细胞因子(TNF-α、IL-6)及M1极化相关基因(CD38、FPR2、GPR18)表达下调;在IL-4诱导M2极化后,与对照组BMDMs相比,M2极化细胞因子 IL-10 及 M2 极化相关基因(EGR2、MGL1、MGL2、FIZZ1、YM1、MRC1、PGC1β)表达上调。结论:TIPE2在巨噬细胞极化中起重要作用,可以抑制LPS/IFN-γ诱导的巨噬细胞M1极化,促进IL-4诱导的巨噬细胞M2极化。第三部分TIPE2负向调控mTORC1促进巨噬细胞M2极化目的:探讨TIPE2促进巨噬细胞M2极化的分子机制。方法:1.将TIPE2过表达,检测IL-4诱导的M2极化信号通路中关键蛋白(STAT6、Akt、S6K1、4E-BP1及其磷酸化),探索TIPE2对M2极化信号通路的影响。2.通过沉默结节性硬化复合物(tuberous sclerosis complex 1,TSC1)将BMDMs哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)组成性激活,检测TIPE2过表达前后M2极化细胞因子IL-10、M2极化相关基因,明确TIPE2过表达对mTORC1组成性激活的BMDMs M2极化的影响。3.通过检测mTORC1组成性激活的BMDMs在IL-4诱导前后Akt信号通路中的关键蛋白(IRS2、Akt及其磷酸化),探索TIPE2调控巨噬细胞M2极化的分子机制。结果:1.用IL-4诱导TIPE2过表达的BMDMs进行M2极化,发现与野生型BMDMs相比,Akt磷酸化增强,mTORC1下游分子S6K1和4E-BP1磷酸化减弱,M2极化细胞因子IL-10及M2极化相关基因表达增强,而STAT6及其磷酸化没有明显差异。2.通过sh-TSC1将BMDMs mTORC1组成性激活,并将TIPE2过表达,用IL-4诱导其进行M2极化,检测M2极化细胞因子IL-10及M2极化相关基因,发现TIPE2过表达可增强因mTORC1组成性激活而减弱了的M2极化。3.用IL-4诱导mTORC1组成性激活的BMDMs进行M2极化,发现与野生型BMDMs相比,IRS2及Akt磷酸化减弱,mTORC1的组成性激活可减弱Akt信号通路的活化。结论:TIPE2负向调控mTORC1促进IL-4诱导的巨噬细胞M2极化。
【图文】：

肺组织,小鼠,哮喘,和血

３结果逡逑３．１肺组织ＨＥ染色逡逑图３．１是两组小鼠（对照组与哮喘组）肺组织ＨＥ染色结果。逡逑结果显示，对照组小鼠肺组织内支气管肺泡结构清晰，支气管上皮完整，支逡逑气管菅壁和血管周围未见明显的炎性细胞浸润。哮喘组小鼠肺组织内支气管壁不逡逑规则，支气管管壁和血管周围有炎性细胞浸润。逡逑！逦ｖｖｘ％ｉ逡逑，U瘈r逡逑尸：／，漏：栥，逡逑％逦＾邋Ｌ邋＊邋＾＇邋ｖ＾逡逑，＼逦＾逦＇邋Ｃ］逡逑１逦＾邋＊邋ｔＴＥｆｃｚｉ邋Ａ逡逑、逆ｓ＜邋，、：？：：逡逑－ｍｍ逡逑＼邋Ｘ邋ｃ；：＂：邋ｆ

肺组织,小鼠,基因,巨噬细胞

Ｍｌ极化标志ｉＮＯＳ邋ｍＲＮＡ、Ｍｌ极化基因ＣＤ３８的表达及Ｍ２极化基因Ａｒｇ－１的表逡逑达，结果显示与对照组小鼠相比，哮喘小鼠肺组织中巨噬细胞Ｍ２极化基因Ａｒｇ－１逡逑的表达明显升高（如图３．３．１），，Ｍｌ极化标志ｉＮＯＳ邋ｍＲＮＡ邋（如图３．３．２）、Ｍｌ极化逡逑基因ＣＤ３８邋（如图３．３．３）的表达无明显改变。以上结果提示在卵清蛋白诱导的哮喘逡逑小鼠模型中，巨噬细胞的Ｍ２极化增强。逡逑１４逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R562.25

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