季也蒙毕赤酵母尿酸酶的重组表达及表征

发布时间：2020-05-31 02:20

【摘要】：寻找生理pH条件下活性及热稳定性足够高尿酸酶是药用及诊断用尿酸酶研究的难点。苛求芽孢杆菌ATCC29604尿酸酶(Bacillus fastidious uricase,BFU)含322个氨基酸残基,其活性形式为四聚体。通过表征BFU及其不同突变体的热稳定性,发现BFU生理条件下无平台期,低浓度体系的半衰期约为26天,而双突变体AER/V144A/Y319R的热稳定性在不同条件下均明显增强,生理条件下平台期最长可达42天,半衰期可达147天,是目前生理条件下稳定性最好的尿酸酶。但该双突变体活性最高的最适pH是碱性,亟待优化该突变体的最适pH到中性。购于中国微生物菌种保藏中心的酵母细胞株C.G.M.C.C 2.1008经菌种鉴定为季也蒙毕赤酵母菌,但无法确定其具体菌种。该酵母株经尿酸诱导表达的季也蒙毕赤酵母尿酸酶(Meyerozyma guilliermondii uricase,MGU)在硼酸硼砂缓冲液中的最适pH为中性。通过串联质谱分析各胰蛋白酶解肽段发现MGU与尿酸酶A5DFP1高度相似;转录组测序交叉验证结果支持该尿酸酶基因的高效诱导表达。根据数据库中A5DFP1的编码序列设计引物,从C.G.M.C.C 2.1008细胞株cDNA中PCR扩增尿酸酶基因后,构建带6His标签的重组表达质粒pDE1-MGU、pDE2-MGU以及无6His标签的表达质粒R-MGU。在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达此真菌尿酸酶,SDS-PAGE发现重组R-MGU肽段约35kDa;MALDI-TOF-MS发现R-MGU肽段约17.43kDa且与天然尿酸酶MGU一致,但按氨基酸序列计算的分子量为33.98 kDa,表明其可能存在化学修饰。测定其动力学参数及抑制剂敏感性等性质,并与天然尿酸酶进行比较,发现带6His标签尿酸酶纯化后比活性接近6.0U/mg;R-MGU米氏常数、竞争性抑制剂的抑制常数及分子量与天然尿酸酶无差别,但R-MGU很难纯化,使其相同条件下的热稳定性比纯化天然酶略差。综上所述,BFU双突变体AER/V144A/Y319R优良的热稳定性使其作为起始酶已非常有吸引力,但其最适p H为碱性,生理条件下活性不高是其最大遗憾,优化该突变体的最适pH到中性有重要意义;MGU具有最适pH为中性的特点,对其进行成功克隆和表达并表征将有利于进一步解析该尿酸酶最适p H的决定因素,以此为基础对BFU双突变体AER/V144A/Y319R进行合理改造,在BFU突变体上生成与MGU类似的相互作用网络,将是优化其最适pH到接近中性的有效策略。
【图文】：

曲线,热失活,苛求芽孢杆菌,突变体

图 1 苛求芽孢杆菌尿酸酶不同突变体热失活曲线Fig.1 Thermoinactivation processes of Bacillus fastidiosus mutants(a): Low concentration of AER (b): High concentration of AER(c): Low concentration of AER/V144A/Y319R (d): High concentration of AER/V144A/Y319R

电泳图,热失活,突变体,电泳

2 突变体 AER/V144A/Y319R 热失活过程电泳 thermoinactivation processes of the mutant AER/V1 7.4 + 30μM 氧嗪酸钾 3: pH 9.2 4: pH 9.2 + 30μ(a):Activity at 100% (b): Activity at 20%杆菌尿酸酶进行研究时发现其活性形式为四对热稳定性明显增强的突变体 AER/V144A100%和活力衰减至20%左右时分别取相同量热失活过程中的四聚体和二聚体变化。电泳体系中的四聚体减少，二聚体有所增加。氧嗪酸钾抑制常数(Ki)尿酸酶野生型(BFU)相比，不同突变体在不导致其 Ki的改变。通过不同抑制剂浓度下记
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R589.7

【参考文献】