羟基酪醇调控软骨细胞自噬缓解晚期氧化蛋白损伤机制研究

发布时间：2020-05-31 01:26

【摘要】：背景和目的自噬及氧化应激在类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)的发病机制中起重要作用。晚期氧化蛋白产物(Advanced Oxidative Protein Products,AOPPs)是氧化应激标志物和炎症介质,触发NADPH氧化酶(NOX)依赖性的活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)产生。自噬作为适应性反应机制保护软骨细胞免受各种环境变化应激。沉默信息调节因子1(SIRT1)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性组蛋白去乙酰化酶,其在调节细胞生理过程中发挥关键作用,包括细胞衰老,细胞生长和细胞存活等,同时也是激活自噬经典的信号通路。羟基酪醇(hydroxytyrosol,HT)具有抗炎,抗氧化和自噬增强的作用。研究表明HT可通过激活自噬SIRT1通路缓解过氧化氢(H202)处理的细胞氧化应激状态。然而,在类风湿性关节炎(RA)的病理生理学中,羟基酪醇是否调节Sirtl信号抵抗AOPPs损伤作用仍然是未知的。因此,本研究旨在研究HT是否缓解AOPPs氧化应激损伤作用以及可能的潜在机制。方法1.HT缓解软骨细胞AOPPs氧化应激损伤用CCK-8kit探索AOPPs对细胞增殖活性的浓度梯度的影响。使用200ug/ml AOPPs处理软骨细胞2h,DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS表达量。采用HT 75umol/ml预处理软骨细胞30min,重复上述实验。2.HT调节自噬缓解软骨细胞AOPPs炎性损伤用westernblot检测细胞自噬相关蛋白,观察自噬相关的时间梯度;设置200ug/ml AOPPs单独组以及200ug/ml AOPPs和不同浓度的HT(10,50和100umol/ml)共处理组,分别处理软骨细胞2h。使用自噬抑制剂氯喹做阴性对照组。3.HT通过SIRT信号通路调节自噬缓解软骨细胞AOPPs损伤HT预处理细胞后加入AOPPs,western blot检测SIRT1蛋白表达情况。使用siRNA特异性干扰SIRT1表达后,继续观察自噬表达情况以及相关的生物学活性和特性的检测。结果1.HT缓解软骨细胞AOPPs氧化应激损伤CCK-8结果显示,AOPPs浓度越大细胞增殖活性越低。AOPPs处理后细胞ROS水平、炎性因子(IL-6,TNFα)、MMP-13、NADPH氧化酶(NOX2和NOX4)明显升高。相反,使用HT预处理明显改善了AOPPs对软骨细胞氧化应激损害。由此可见,HT可缓解AOPPs对软骨细胞细胞毒性。2.HT调节自噬缓解软骨细胞AOPPs炎性损伤HT预处理细胞后与AOPPs共培养,细胞自噬水平增高。加入自噬剂氯喹,HT所介导的软骨细胞保护作用明显消失,进一步论证调节自噬是HT保护软骨细胞免受AOPPs损伤的重要机制。3.HT通过SIRT1信号通路调节自噬缓解软骨细胞AOPPs损伤与AOPPs单独处理组相比,HT显著提高了SIRT1蛋白表达。使用siRNA特异性干扰Sirt-1的表达后,由HT介导的自噬增强作用消失,与此同时AOPPs依赖性的NADPH氧化酶(NOX2和NOX4)表达升高。结论HT通过SIRT1通路增强细胞自噬缓解AOPPs引起氧化应激及炎性损伤。
【图文】：

图１－２软骨细胞使用或不使用ＨＴ预处理半小时，后用２００ｍｇ／ｍｌ的ＡＯＰＰｓ处理不同时间（０、逡逑６、１２、２４、４８ｈ）。数据表示为平均值土ＳＥＭ，邋ｎ邋＝邋３。与对照组相比，＊Ｐ＜０．０５和＊＊Ｐ＜０．０１。逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－２邋Ｔｈｅ邋ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ邋ｗｅｒｅ邋ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｏｒ邋ｗｉｔｈｏｕｔ邋ＨＴ邋７５｜ｉＭ邋ｆｏｒ邋３０ｍｉｎ邋ａｎｄ邋ｔｈｅｎ逡逑ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＡＯＰＰｓ邋２００ｕｇ／ｍｌ邋ｆｏｒ邋ｔｈｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅ．邋＊Ｐ邋＜邋０．０５邋ａｎｄ邋＊＊Ｐ邋＜邋０．０１邋ｖｓ．邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ｇｒｏｕｐ．邋＆邋Ｐ邋＜邋０．０５邋ＡＯＰＰｓ邋ｇｒｏｕｐ邋ｖｓ．ＨＴ＋ＡＯＰＰｓ邋ｇｒｏｕｐ邋ａｔ邋６ｈｏｕｒ．逡逑３．邋ＨＴ缓解ＡＯＰＰｓ诱导的软骨细胞细胞内活性氧（ＲＯＳ）生成逡逑之前研究表明，ＡＯＰＰｓ作为晚期氧化蛋白产物，显著升高细胞内ＲＯＳ水平逡逑从而造成细胞氧化应激损伤。为了进一步明确ＨＴ的保护作用，，通过ＨＴ预处理逡逑暴露于ＡＯＰＰｓ软骨细胞，与单独ＡＯＰＰｓ处理组相比，细胞内ＲＯＳ水平明显降逡逑低。以上证明了邋ＨＴ可以降低细胞ＲＯＳ生成从而缓解ＡＯＰＰｓ所致的氧化应激损逡逑１２逡逑

邋＾邋＾逡逑Ｔｉｍｅ逡逑图１－２软骨细胞使用或不使用ＨＴ预处理半小时，后用２００ｍｇ／ｍｌ的ＡＯＰＰｓ处理不同时间（０、逡逑６、１２、２４、４８ｈ）。数据表示为平均值土ＳＥＭ，邋ｎ邋＝邋３。与对照组相比，＊Ｐ＜０．０５和＊＊Ｐ＜０．０１。逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－２邋Ｔｈｅ邋ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ邋ｗｅｒｅ邋ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｏｒ邋ｗｉｔｈｏｕｔ邋ＨＴ邋７５｜ｉＭ邋ｆｏｒ邋３０ｍｉｎ邋ａｎｄ邋ｔｈｅｎ逡逑ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＡＯＰＰｓ邋２００ｕｇ／ｍｌ邋ｆｏｒ邋ｔｈｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅ．邋＊Ｐ邋＜邋０．０５邋ａｎｄ邋＊＊Ｐ邋＜邋０．０１邋ｖｓ．邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ｇｒｏｕｐ．邋＆邋Ｐ邋＜邋０．０５邋ＡＯＰＰｓ邋ｇｒｏｕｐ邋ｖｓ．ＨＴ＋ＡＯＰＰｓ邋ｇｒｏｕｐ邋ａｔ邋６ｈｏｕｒ．逡逑３．邋ＨＴ缓解ＡＯＰＰｓ诱导的软骨细胞细胞内活性氧（ＲＯＳ）生成逡逑之前研究表明，ＡＯＰＰｓ作为晚期氧化蛋白产物，显著升高细胞内ＲＯＳ水平逡逑从而造成细胞氧化应激损伤。为了进一步明确ＨＴ的保护作用，通过ＨＴ预处理逡逑暴露于ＡＯＰＰｓ软骨细胞，与单独ＡＯＰＰｓ处理组相比，细胞内ＲＯＳ水平明显降逡逑低。以上证明了邋ＨＴ可以降低细胞ＲＯＳ生成从而缓解ＡＯＰＰｓ所致的氧化应激损逡逑１２逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R593.22

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本文编号：2689041