MiR-375,Pdx-1和MafA协同表达对人脂肪间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的影响探究

发布时间：2020-05-31 16:32

【摘要】：糖尿病是全球最普遍的代谢疾病之一,目前的治疗方法有胰岛移植及使用降血糖药物等,但前者缺乏移植供体且有移植排异风险,后者会出现较多不良反应。在细胞水平上可通过定向诱导的方法,将多潜能性干细胞向具有胰岛素分泌功能的细胞进行诱导分化,可为治疗糖尿病提供一种新的疗法。人脂肪间充质干细胞(human adipose mesenchymal stem cells,haMSCs)来源于脂肪组织,易于分离培养,且较少涉及到医学伦理问题,是糖尿病等细胞治疗的理想来源。MiR-375、Pdx1和MafA在胰腺、胰岛细胞发育和成熟过程中起到重要的调控作用。miR-375作为胰岛特异性miRNA,参与基因表达的转录后调控,可以促进细胞向胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells,IPCs)分化。Pdx1是胰腺发育中重要的转录因子,可调节胰岛素的分泌,并激活特异性基因的表达。MafA在Pdx1等基因的协同作用下,可诱导体外胰岛素的分泌。为了探究过表达这三种转录因子对haMSCs向IPCs分化的影响,我们利用慢病毒载体构建了稳定过表达miR-375、Pdx-1以及MafA的haMSC细胞株,并将其诱导分化为胰岛素分泌细胞。首先,我们从捐赠者的前腹壁切除的脂肪组织中分离培养脂肪间充质细胞,在体外培养并多次传代后,细胞形态仍保持为与成纤维细胞相似的纺锤形,且贴壁生长状态良好。通过茜素红、阿尔新蓝、油红O和BODIPY探针染色分别对haMSCs成骨、成软骨和成脂诱导分化进行鉴定,结果显示haMSCs具有分化成骨、软骨和脂肪细胞的能力;通过流式细胞术分析细胞表面特异性标志物的表达,结果显示表达CD44、CD73、CD90、CD105、CD166等脂肪间充质细胞的特异性标志物,而CD34、CD45、CD133、CD271等表达阴性,表明我们成功分离得到haMSCs。其次,根据miR-375、Pdx1和MafA的基因序列构建慢病毒载体,对haMSCs进行感染,获得过表达miR-375、过表达miR-375和Pdx-1、过表达miR-375、Pdx-1和MafA细胞株。MiR-375、Pdx-1和MafA过表达的细胞在感染72 h后可观察到细胞中绿色荧光蛋白的表达,感染率约为80%,且细胞传代后依然表达绿色荧光蛋白,表明稳定过表达细胞株建系成功。最后,利用三阶段的分化体系进行分化,先在添加CYC、NOGGIN和RA的基础高糖培养基中培养4天后,再用含有Nic、NOGGIN和GLP1的基础高糖培养基培养3天,最后于添加Nic、NOGGIN、GLP1和IGF1的IMDM培养基培养7天。该体系可将haMSCs成功诱导分化为IPCs。对过表达细胞向IPCs诱导分化后的RT-PCR检测结果显示,与未转染的细胞相比,Insulin、Glucagon、Pdx1、Ngn3、Foxa2、Isl.1、Nkx6.1等胰腺相关基因的表达均有上调。Insulin、Glucagon的相对表达量最高可上调约47.7倍和15.7倍,Pdx1由于进行慢病毒过表达最高可上调约500倍,Somatostatin最高可上调约36倍,Ngn3、Foxa2、Isl.1的相对表达量最高可上调约7倍,Nkx6.1最高可上调3倍左右,表明过表达胰腺相关因子确实可促进细胞的胰向分化。其中同时过表达miR-375、Pdx-1和MafA的细胞与其他组细胞相比,Insulin、Pdx1和Ngn3的相对表达量上调程度更高,而Glucagon的上调程度较低。免疫荧光染色的结果显示,细胞呈现Insulin、Glucagon、Pdx1和Somatostatin的表达阳性。Elisa测定结果显示,同时过表达miR-375、Pdx-1和MafA的组中平均单个细胞的胰岛素分泌量为3.6×10~(-4)μg,而在其他组细胞中未检测到胰岛素的分泌。研究证明,过表达MiR-375、Pdx-1和MafA可以促进人脂肪间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的分化,且同时表达miR-375、Pdx-1和MafA的细胞与过表达miR-375、过表达miR-375和Pdx-1的细胞相比,具有更好的分化效果。表明过表达多种胰向分化转录因子可协同促进haMSCs向IPCs的分化,可以为用自身细胞治疗糖尿病提供临床研究的可能。
【图文】：

图 1.1 haMSCs 不同时间、不同代次的生长状态A：第 3 代 haMSC 培养 48 h 后的形态。B：第 3 代 haMSC 培养 72 h 后的形态。C：第 8 代 haMSC 培养48 h 后的形态。（标尺为 100 μm）Figure 1.1 The morphology of of haMSCs at different generation

98.2%，90.4%；阴性标志物中除 CD14 的表达为 0.6%，CD34、CD45、CD133、CD271 的表达均为 0%（图1.2）。由此可见，细胞阳性表面标志物的表达均大于 90%，阴性表面标志物的表达均接近于 0或等于 0，，与已发表的研究结论一致，表明该细胞可表达脂肪间充质干细胞的特异性细胞表面标志物。
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.1

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本文编号：2690148