L—型钙通道在饮水型氟致脑海马损伤过程中的作用及机制

发布时间：2020-06-01 05:22

【摘要】：氟是人体必需的微量元素,但过量摄入会造成多系统、多器官的毒性作用,称为地方性氟中毒,简称地氟病。氟中毒不仅能够损害牙齿、骨骼等骨相器官,还可对非骨相器官造成损伤,如脑。氟中毒可引起细胞内钙离子超载,诱导钙信号转导系统中与学习记忆功能相关的基因或蛋白表达异常,进而对神经系统造成损伤。Ca~(2+)是细胞内重要的信息分子,L-型钙离子通道在调节胞质内Ca~(2+)的水平中发挥重要作用,但氟致细胞内钙离子超载的原因及其对脑海马内L-型钙离子通道及下游凋亡相关分子的影响鲜有相关报道。亚慢性和慢性小鼠氟中毒实验均选用140只初断乳健康ICR雄性小鼠,适应一周后,随机平均分为7组。对照组(C)、高氟组(HF)、低氟组(LF)、高氟激动剂组(HF+FPL)、高氟拮抗剂组(HF+NIF)、低氟激动剂组(LF+FPL)、低氟拮抗剂组(LF+NIF)。对照组饮用自来水,高氟组和低氟组分别饮用30和5mg/L的氟化钠溶液。分别饲养90天与180天,染氟结束前一周,按体重5mg/(kg·d)分别腹腔注射生理盐水、钙离子通道激动剂FPL64176、钙离子通道拮抗剂Nifedipine。联合氟染毒结束后,观测小鼠空间自主探索能力和学习记忆力及观察氟斑牙发生情况、检测各组血/尿氟含量,以验证小鼠氟中毒模型是否复制成功。再检测SOD、GSH-PX活力及MDA含量、海马CA_1区神经细胞形态和细胞凋亡情况、钙离子通道Cav1.2、钙调蛋白CaM、钙调蛋白激酶CaMKⅡ、Bcl-2和Bax基因和蛋白表达水平。通过上述实验,探讨饮水型氟暴露致脑功能损伤的分子机制,初步探明L-型钙通道在饮水型氟中毒致脑功能损伤过程中的作用,进一步完善氟致“钙矛盾”学说,探求治疗氟中毒的新途径和新方法。研究结果如下:(1)血/尿氟含量测定结果显示,与对照(C)组比,3月龄和6月龄各染氟组尿氟含量显著上升(P0.05)。另外,LF组切齿有较轻的氟斑牙症状。HF组切齿氟斑牙症状显著。根据以上指标可认为本研究氟中毒模型复制成功。(2)行为检测结果显示,与C组比,3月龄和6月龄小鼠不同氟浓度暴露后跑动格数和站立次数较对照组有下降趋势,逃避潜伏期显著下降(P0.05),穿越平台次数明显下降,表明氟染毒小鼠空间探索和学习记忆能力下降。(3)脑组织相关酶检测结果显示,与C组比,3月龄和6月龄染氟组小鼠脑组织GSH-Px较对照组活力降低。SOD活力及MDA含量显著升高(P0.05)。6月龄较3月龄HF+NIF组MDA含量显著下降(P0.05)。(4)海马CA_1区神经细胞形态和凋亡检测结果显示,与C组比,氟染毒3个月和6个月小鼠脑海马染氟组细胞形态改变。3月龄及6月龄不同浓度的氟染毒组脑海马CA_1区细胞凋亡率显著性升高(P0.05),拮抗剂组海马CA_1区细胞凋亡率较激动剂组显著降低(P0.05),但高于对照组。染氟6个月较3个月相同浓度氟处理组海马CA_1区细胞凋亡率极显著升高(P0.01)。(5)PCR及Western blot检测结果显示,与C组比,HF和LF组3月龄和6月龄海马内Cav1.2基因表达水平均显著升高(P0.05),但蛋白表达水平显著下降。3月龄和6月龄CaM基因表达水平显著下降(P0.05),但蛋白表达水平升高,其表达水平不一致的原因,有待进一步阐明。3月龄CaMKⅡ基因和蛋白表达水平均有下降趋势,而6月龄显著升高。3月龄和6月龄Bax基因和蛋白表达水平及Bax/Bcl-2基因和蛋白表达水平比值均显著升高(P0.05),而Bcl-2基因表达水平均显著降低(P0.05)。与相同氟浓度染毒组比,3月龄激动剂组Cav1.2基因和蛋白表达水平显著下降(P0.05),拮抗剂组有降低趋势。3月龄和6月龄CaM基因和蛋白表达水平有升高的趋势,拮抗剂组有下降的趋势。3月龄激动剂组和拮抗剂组CaMKⅡ基因和蛋白表达水平均有下降的趋势,而6月龄无统计学意义。3月龄激动剂组和拮抗剂组Bax基因和蛋白表达水平无明显显著性(P0.05),而6月龄激动剂组有上升的趋势,拮抗剂组有下降趋势。3月龄和6月龄激动剂组Bcl-2基因和蛋白表达水平均有下降趋势,拮抗剂组有升高趋势。3月龄和6月龄激动剂组Bax/Bcl-2基因和蛋白表达水平比值显著升高(P0.05),拮抗剂组有下降趋势。综合上述,本研究在饮水型氟中毒模型复制成功的基础上,所得研究结果表明,亚慢性和慢性氟中毒小鼠学习记忆力、自主行为和探究能力下降,脑组织抗氧化能力降低,海马CA_1区凋亡细胞数增加。这可能与脑海马内钙离子通道Cav1.2蛋白和凋亡相关分子Bcl-2、Bax蛋白表达异常及Bax/Bcl-2表达比值升高有关,且海马神经细胞内上述分子的表达水平与氟暴露的剂量及时间呈正相关。提示,脑海马内Bcl-2、Bax凋亡途径可能是氟致小鼠行为改变及脑神经细胞凋亡的分子机制之一。此外,Ca~(2+)通道激动剂FPL64176能进一步加剧氟引起的小鼠学习记忆能力的损伤,并并脑海马细胞内钙离子通道Cav1.2及下游CaMK II、CaM与Bcl-2、Bax基因和蛋白表达异常程度加基,表现出协同毒性作用,而钙离子拮抗剂Nifedipine则可逆转氟中毒对小鼠上述行为及分子异常表达,提示钙离子拮抗剂Nifedipine可能是一种新型有效的抗氟药。
【图文】：

高；与 LF 组相比，3 月龄小鼠 LF+FPL 组尿钙含量显著降低(P<0.05)，组极显著降低(P<0.01)。与 3 月龄比，6 月龄小鼠 HF+NIF 组、LF+FPL 组尿钙含量显著降低(PLF+NIF 组尿氟含量极显著降低(P<0.01)。3.2 小鼠下切齿氟斑牙观察结果3 月龄和 6 月龄各组小鼠下切齿通过显微镜观察并拍照，观察结果见

图 2 3 月龄和 6 月龄小鼠 Morris 水迷宫穿越平台数检测结果(n=10)re 2 Results of Morris water maze crossing platform in 3 and 6 months old mice(*P<0.05，**P<0.01，与 C 组比;#P<0.05，与 HF 组比;+P<0.05，++P<0.01，与0.05，△ △P<0.01,与 3 月龄比图 2 可见，与 C 组比，3 月龄小鼠 HF 组穿越平台数显著下降(P<PL 组小鼠穿越平台数极显著下降(P<0.01)。6 月龄小鼠 LF 组、LF+台数极显著下降(P<0.01)，LF+NIF 组穿越平台数显著降低(P<0.0比，6月龄小鼠HF+NIF组显著升高(P<0.05)。与LF组比，3月龄小鼠L平台数极显著下降(P<0.01)，LF+NIF 组穿越平台数显著降低(P<0鼠 LF+FPL 组、LF+NIF 组穿越平台数无显著性变化(P>0.05)。 3 月龄比，6 月龄小鼠 LF 组、LF+FPL 组穿越平台数显著降低(P<小鼠脑海马 CA1区细胞形态结构观察结果
【学位授予单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R599.1

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本文编号：2691003