过表达IL-10的脂肪间充质干细胞促进糖尿病小鼠慢性创面愈合的研究

发布时间：2020-06-03 23:36

【摘要】：研究背景糖尿病溃疡是一种严重的慢性难愈合性创面,常导致患者截肢甚至死亡,给患者及其家庭造成极大的损伤。近年来,干细胞用于组织修复的研究越来越多。脂肪组织来源的间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)具有来源广泛、容易获得的优点,ADSCs能够加速创面愈合并减少瘢痕增生,特别是对于慢性创面,使用传统的治疗方法病人无法痊愈,ADSCs为这些患者带来了希望。糖尿病溃疡创面相比正常创面在炎症阶段的时间更长,产生大量炎症细胞因子,使糖尿病溃疡难以愈合。巨噬细胞在慢性创面的炎症反应中发挥关键作用,其中M1型巨噬细胞分泌产生促炎细胞因子(如IL-1β、TNF-α、IL-6等)、一氧化氮、蛋白酶和宿主防御活性氧,抑制组织损伤修复;M2型巨噬细胞分泌产生抗炎因子(IL-10等)、鸟氨酸和多胺,缓解炎症反应,促进组织损伤修复;在慢性创面中巨噬细胞长期呈现M1表型,释放炎症因子导致组织损伤不能愈合。在调节巨噬细胞从M1型向M2型转化的研究中,IL-10因其强大的抗炎功能而受到研究者和临床医生的特别关注,IL-10虽能有效的降低炎症,但其在创面的半衰期仅有2h左右,如何在慢性创面延长其发挥作用是一个需要解决的问题。目前大部分研究单独应用ADSCs促进创面愈合,还有些研究将ADSCs与生物材料相结合或者采用ADSCs的条件培养基或浓缩物(冻干粉)促进创面的愈合,也有研究将ADSCs与抗炎因子相结合,抑制慢性创面的炎症反应从而加速创面的愈合。我们的研究拟通过基因工程技术在ADSCs中过表达IL-10,将ADSC-IL10移植到糖尿病小鼠创面上,利用IL-10促进M2巨噬细胞转化的作用,联合ADSCs实现糖尿病溃疡创面的快速愈合。研究目的1.检测ADSCs过表达IL-10(简称ADSC-IL10)对ADSCs生物学特性的影响;2.明确ADSC-IL10促进糖尿病小鼠创面愈合的有效性;3.探讨ADSC-IL10促进糖尿病小鼠创面愈合的机制。研究方法1.过表达IL-10对ADSCs生物学特性的影响(1)利用慢病毒将编码小鼠IL-10蛋白的基因整合到人ADSCs细胞中;(2)利用ELISA试剂盒检测ADSC-IL10体外培养上清中IL-10蛋白的表达量;(3)利用流式细胞学技术分析ADSC-IL10的表面干细胞标志物(CD44、CD73、CD90、CD105);(4)采用细胞划线法、MTT法检测ADSC-IL10的迁移和增殖能力;(5)将ADSC-IL10向成脂和成骨细胞方向诱导分化,采用荧光实时定量PCR技术检测成脂标志基因PPARγ和成骨标志基因RUNX2的表达量。2.ADSC-IL10条件培养基对创伤修复相关细胞的作用(1)采用 ADSC-IL10 条件培养基(ADSC-IL10-CM)和 ADSC-PCDH 的条件培养基(ADSC-CM)培养小鼠腹腔巨噬细胞(Raw 264.7),同时以DMEM低糖培养基作为对照。培养12h后,收集Raw 264.7细胞提取mRNA,采用qPCR技术检测Raw 264.7细胞类型,其中M1型通过CD86判断,M2型通过Arg-1、CD206判断;采用qPCR技术检测IL-1β、IL-6、IL-10、MCP-1等炎症因子以及EGF、VEGF、TGFβ-1等生长因子的表达量。(2)采用transwell的方法检测ADSC-IL10-CM和ADSC-CM对正常皮肤成纤维细胞迁移的影响;采用划线法检测ADSC-CM对人永生化的表皮细胞的迁移的影响。3.移植ADSC-IL10促进糖尿病小鼠创面的愈合及机制的研究(1)采用高脂高糖饮食+链脲佐菌素(STZ;150mg/kg,腹腔注射1次)诱导糖尿病小鼠模型,糖尿病小鼠模型(随机血糖高于16.7 mmol/L)诱导成功15天后,选取45只的高血糖小鼠纳入研究。(2)将45只高血糖小鼠纳随机分为对照组、ADSC-PCDH组和ADSC-IL10组,每组15只。在小鼠背部1.5cm×1.5cm创面,ADSC-IL10组创面移植1×106个ADSC-IL10细胞,ADSC-PCDH组移植1×106个ADSC-PCDH,对照组移植等体积的0.9%的生理盐水。在不同时间点观察小鼠创面愈合情况并拍照记录。(3)分别取第3天和第7天的小鼠创面组织进行组织学染色和qPCR。组织学染色主要通过HE染色观察创面愈合状况,免疫荧光(CD206、Arg-1)鉴定小鼠皮肤组织中M2型巨噬细胞数量;qPCR检测CD206、Arg-1基因的表达量鉴定创伤组织中巨噬细胞类型;检测IL-1β、IL-6、IL-10、MCP-1等炎症因子判断创伤组织的炎症状态;检测EGF、VEGF、TGFβ-1生长因子在创伤组织中的表达量。研究结果1、ADSC过表达IL-10对ADSCs细胞生物学特性的影响(1)ADSC-IL10、ADSC-PCDH和ADSCs细胞上清中IL-10的浓度分别为8245±294.6 pg/ml、358.7±30.36 pg/ml 和 342.8±13.64 pg/ml,ADSC-IL10 细胞上清中IL-10的含量相比ADSC-PCDH和ADSCs显著升高。(2)ADSC-IL10、ADSC-PCDH 和 ADSCs 的干细胞标志物 CD44、CD73、CD90、CD105均阳性表达,相互之间未见明显差异。(3)ADSC-IL10、ADSC-PCDH和ADSCs组的细胞均在24h时完成迁移,细胞迁移的距离和数量没有显著差异。(4)ADSC-IL10、ADSC-PCDH和ADSCs组的细胞成脂分化诱导7天,脂滴的形成和油红O染色没有显著性差异,成脂标志基因PPARγ的表达在三组之间没有显著性差异。ADSC-IL10、ADSC-PCDH和ADSCs组的细胞成骨分化诱导21天,茜素红染色未见显著差异,成骨标志基因RUNX2的表达在三组之间没有显著性差异。2、ADSC-IL10-CM对创伤修复相关细胞的作用(1)采用ADSC-IL10-CM培养Raw 264.7细胞,结果显示Raw 264.7细胞在体外试验中Arg-1和CD206高表达。促炎因子IL-1β、IL-6、MCP-1低表达,抑炎因子IL-10高表达;Raw 264.7细胞在ADSC-IL10-CM中高表达生长因子EGF、TGFβ-1、VEGF。说明Raw 264.7细胞在ADSC-IL10-CM的作用下向M2型分化,炎症因子的表达量下降,生长因子的表达量上升。(2)ADSC-IL10-CM组和ADSC-CM组与对照组相比能够促进皮肤成纤维细胞的迁移;ADSC-IL10组比ADSC-PCDH组成纤维细胞迁移的数量更多。ADSC-CM促进人永生化的表皮细胞的迁移。3、移植ADSC-IL10促进糖尿病小鼠创面的愈合及机制(1)ADSC-IL10组糖尿病小鼠愈合速度(19天愈合)明显高于ADSC-PCDH组(21天愈合)和对照组(25天愈合)。采用imageJ统计三组间在不同时段的愈合面积,结果显示ADSC-IL10组愈合面积明显高于ADSC-PCDH组和对照组,且存在统计学差异。(2)通过对CD206进行的免疫荧光染色显示第3天小鼠皮肤组织M2型巨噬细胞并无明显差异。第7天时,免疫荧光显示ADSC-IL-10组创伤组织中Arg-1和CD206的表达量高于ADSC-PCDH组,且ADSC-PCDH组高于对照组;qPCR检测组织中Arg-1和CD206的表达量也显示了同样的结果。提示M2型巨噬细胞在ADSC-IL-10组创面组织中的含量增加。(3)与对照组相比,移植ADSC-IL10组糖尿病小鼠创面促炎因子IL-1β的表达量下降,抑炎因子IL-4R、IL-10表达量上升;生长因子EGF、TGFβ-1、VEGF的表达量上升。提示移植ADSC-IL10组小鼠炎症反应下降,生长因子表达量上升。研究结论综上,我们的研究表明过表达IL-10不会影响ADSCs细胞的生物学特性,在小鼠糖尿病创面中移植ADSC-IL10相比单独ADSCs移植能更快促进糖尿病小鼠创面的愈合。ADSC-IL10加速创面愈合的机制可能包括以下方面相关:ADSC-IL10促进糖尿病小鼠创面M2型巨噬细胞的表达,抑制IL-11β、IL-6、MCP-1等促炎因子的分泌,并促进EGF、TGFβ-1、VEGF生长因子的表达,促进创面皮肤成纤维细胞和表皮细胞的迁移。
【图文】：

镜下观察分离纯化的脂肪间充质干细胞，发现其大部分在２４ｈ时内己经贴壁，逡逑细胞边境清晰、呈纺锤形，有小的胞浆突起，原代细胞培养５天左右细胞能够完全逡逑融合，，生长状态良好。（图１．１）我们采用的ＡＤＳＣ细胞均为Ｐ５代之内的细胞。逡逑酾歫逡逑图１．１原代ＡＤＳＣｓ和Ｐ４代ＡＤＳＣｓ细胞形态逡逑（Ａ）原代ＡＤＳＣｓ细胞，细胞较小，上部漂浮少量的油脂；（Ｂ）邋Ｐ４代ＡＤＳＣｓ细胞，己生逡逑长至９５％以上，此时的细胞可进行传代培养。图中标尺长度为ｌＯＯｕｍ。逡逑采用流式细胞学技术对提取的Ｐ３代ＡＤＳＣｓ进行干细胞标志物（ＣＤ４４、ＣＤ７３、逡逑）g汗０和〔ゞ罕０５）尖Iǎ嘭峁銃允荆海浚炒

本文编号：2695570