Tim-3对高糖环境下血管内皮细胞迁移的影响

发布时间：2020-06-09 09:49

【摘要】：目的:动脉粥样硬化是2型糖尿病大血管病变的病理基础,而启动动脉粥样硬化早期改变的就是血管内皮功能异常,内皮功能异常的表现之一就是迁移功能的变化。T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域因子3(T cell immunoglobulin and mucin-domain containing molecule 3,Tim3)是表达于内皮细胞的一种糖蛋白,与内皮细胞移动变化的相关性目前未见报道。本研究目的就是确定Tim3蛋白在不同葡萄糖浓度下是否对内皮细胞迁移功能产生影响。方法:以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为研究对象,应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,阻断内皮细胞Tim3蛋白表达,并在不同葡萄糖浓度下对细胞进行培养。在本研究中,实验分为三大组:正常对照组,si-Tim3干扰组,si-Tim3无效干扰组。三组细胞分别在正常培养基及赋糖培养基(5.5mmol/L葡萄糖或60mmol/L葡萄糖)中培养24h、48h、72h。显微镜下观察各组细胞不同时间点细胞形态及细胞迁移变化。应用划痕及Transwell实验评估细胞迁移功能的变化,并计算培养72h细胞的细胞迁移率和迁移数量。同时收集培养72h细胞,通过Real-time PCR、Western blot分别检测Tim3及与细胞迁移能力相关的标志蛋白(E-cadherin、α-catenin、Vimentin和ZEB1)的mRNA与蛋白表达水平,并分别应用2~(-△△CT)方法和凝胶图象处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)对其进行半定量分析。结果:1.细胞形态正常培养下,正常对照组及Tim3无效干扰组细胞排列整齐,形态正常;而Tim3干扰组细胞则排列紊乱、不规则细胞比例增多。赋糖培养下,当糖浓度为5.5mmol/L时,各组细胞形态与在正常培养下的各对应细胞组相似;在糖浓度为60mmol/L时,正常细胞组的细胞形态也出现异常,Tim3干扰组细胞排列紊乱进一步加重。2.细胞迁移变化2.1划痕实验:正常培养下,正常对照组迁移率为82.85±3.75%,无效干扰组细胞迁移率为82.57±2.15%,Tim3干扰组细胞迁移率为60.37±7.86%,与正常对照组相比明显降低(P0.05)。赋糖培养下,在糖浓度为5.5mmol/L时,正常细胞组、Tim3无效干扰组、Tim3干扰组细胞迁移率分别为82.34±3.52%、79.13±4.91%、65.13±4.08%,与正常培养下的各对应细胞组一致;在糖浓度为60mmol/L时,上述三组细胞迁移率分别为61.36±7.42%、61.24±7.17%、35.58±5.25%,Tim3干扰组细胞迁移率显著低于正常细胞组(P0.05),此条件下培养的三组细胞迁移率均明显低于正常培养下各对应细胞组的细胞迁移率。2.2 Transwell实验:通过迁移细胞数量来反应细胞移动能力。正常培养下,正常对照组迁移细胞数为144±16个,Tim3干扰组迁移细胞数为53±7个,两组相比差异显著(P0.05)。Tim3无效干扰组迁移细胞数与正常对照组接近,为148±16个。赋糖培养下,在糖浓度为5.5mmol/L时,正常细胞组、Tim3无效干扰组、Tim3干扰组迁移细胞数分别为127±14、134±20、52±8个,与正常培养下的各组情况相似;在糖浓度为60mmol/L时,正常细胞组迁移细胞数为56±8个,Tim3无效干扰组迁移细胞数为52±5个,Tim3干扰组迁移细胞数为19±4个,较正常细胞组显著减少(P0.05);此条件培养下的三组细胞迁移数均明显低于正常培养下各对应细胞组的细胞迁移数。3.移动标志相关蛋白的mRNA表达水平变化本研究检测了如下四种蛋白:E-cadherin、α-catenin、Vimentin和ZEB1。正常培养下,正常对照组E-cadherin、α-catenin mRNA表达水平分别为1.00±0.06和1.00±0.05,Vimentin和ZEB1 m RNA表达水平分别为1.00±0.05和1.00±0.10。Tim3无效干扰组上述各蛋白mRNA表达水平分别为1.13±0.07、0.93±0.06、0.98±0.05和0.92±0.07。Tim3干扰组各蛋白的mRNA表达水平则分别为2.78±0.29、3.35±0.14、0.44±0.02、0.67±0.02,与正常对照组相比,E-cadherin、α-catenin mRNA表达水平显著增高,而Vimentin和ZEB1 m RNA表达水平显著下降(P0.05);进行赋糖培养,糖浓度为5.5mmol/L时,各蛋白mRNA表达水平与正常培养下各对应细胞组相似;在糖浓度为60mmol/L时,正常细胞组E-cadherin和α-catenin mRNA表达水平分别为3.25±0.11和4.23±0.33,Vimentin和ZEB1mRNA表达水平分别为0.37±0.03和0.49±0.03。无效干扰组E-cadherin、α-catenin mRNA表达水平分别为3.12±0.24和3.96±0.13,Vimentin和ZEB1mRNA表达水平分别为0.36±0.02和0.49±0.04,与正常细胞组相比无明显差异。Tim3干扰组E-cadherin、α-catenin mRNA表达水平分别为4.25±0.29和5.34±0.12,Vimentin和ZEB1mRNA表达水平分别为0.22±0.01和0.18±0.01,与正常细胞组相比差异有统计学意义(P0.05)。上述四种蛋白mRNA表达水平与正常培养下各对应细胞组相比,E-cadherin和α-catenin明显增高,Vimentin和ZEB1明显下降,在Tim3干扰组表现更为明显,组间比较均具有统计学意义(P0.05)。4.移动标志相关蛋白水平变化本研究检测了如下四种蛋白:E-cadherin、α-catenin、Vimentin和ZEB1。正常培养下,正常对照组E-cadherin、α-catenin蛋白表达水平分别为1.00±0.07和1.00±0.13,Vimentin和ZEB1蛋白表达水平分别为1.00±0.07和1.00±0.05。Tim3无效干扰组上述各蛋白表达水平分别为0.97±0.11、1.13±0.13、1.06±0.09和0.93±0.09。Tim3干扰组各蛋白的表达水平则分别为2.43±0.24、3.72±0.33、0.35±0.05和0.41±0.03,与正常对照组相比,E-cadherin、α-catenin蛋白表达水平显著增高,而Vimentin和ZEB1表达水平显著下降(P0.05);进行赋糖培养,在糖浓度为5.5mmol/L时,各蛋白表达水平与正常培养下各对应细胞组相似;在糖浓度为60mmol/L时,正常细胞组E-cadherin、α-catenin蛋白表达水平分别为2.34±0.11和3.65±0.23,Vimentin和ZEB1表达水平分别为0.37±0.04和0.40±0.04。无效干扰组E-cadherin、α-catenin蛋白表达水平分别为2.38±0.14和3.68±0.24,Vimentin和ZEB1表达水平分别为0.36±0.07和0.36±0.04,与正常细胞组相比无明显差异。Tim3干扰组E-cadherin、α-catenin蛋白表达水平分别为4.67±0.36和6.20±0.42,Vimentin和ZEB1表达水平分别为0.24±0.03和0.12±0.02,与正常细胞组相比差异有统计学意义(P0.05)。上述四种蛋白表达水平与正常培养下各对应细胞组相比,E-cadherin、α-catenin明显增高,而Vimentin和ZEB1明显下降,在Tim3干扰组表现更为明显,组间比较均具有统计学意义(P0.05)。结论:1、Tim3蛋白和高糖均与血管内皮细胞的迁移功能有关,在高糖或Tim3蛋白表达下降时,内皮细胞的迁移能力降低。2、Tim3对内皮细胞迁移的影响独立于葡萄糖作用,但两者存在叠加作用,在高糖环境下阻断Tim3蛋白会加重血管内皮迁移功能的损伤。
【图文】：

21图 1. RNA 干扰后各组 Tim3 mRNA 表达水平对照组、NC 为无效干扰序列组、siRNA-1、siR列组（与正常对照组相比 , **P＜0.01；与 siRN

图 2 Western blot 检测 Tim3 蛋白表达水平：Control 为正常对照组、NC 为无效干扰组、siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3别为 3 条干扰序列组（与正常对照组相比，**P＜0.01；与 siRNA-1 比较，，#P＜0.01）
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2

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本文编号：2704513