2型糖尿病患者脂肪来源干细胞促创面愈合能力的实验研究

发布时间：2020-06-11 15:58

【摘要】：目的:通过分离、培养正常脂肪来源干细胞(normal Adipose-derived stem cells,nASCs)与糖尿病脂肪来源干细胞(diabetic Adipose-derived stem cells,dASCs),体外对比研究两种细胞的形态、表面标志、增殖与分化功能,体内对比研究两种细胞局部移植后压疮创面的愈合情况,探讨dASCs是否保留促创面愈合能力,为dASCs自体移植治疗慢性创面提供实验依据。方法:1、经知情同意后,于遵义医学院附属医院烧伤整形外科患者术中无菌条件下获取糖尿病病人脂肪组织和非糖尿病病人脂肪组织(即正常的脂肪组织)标本。采用胶原酶消化法提取脂肪来源干细胞(Adipose-derived stem cells,ASCs),用含胎牛血清的低糖DMEM培养基培养细胞,胰酶消化传代。倒置显微镜下观察两种不同来源细胞的形态,流式细胞仪检测第三代细胞表面标志的表达情况。2、取传至第三代的nASCs和dASCs,采用MTT法检测两种来源细胞的增殖能力并绘制生长曲线;将两种细胞接种于六孔板后分别诱导成脂、成骨,21天后分别行油红及茜素红染色观察成脂及成骨情况;取诱导成骨及成脂两周后的细胞进行实时荧光定量PCR检测脂肪特有基因PPAR-γ及成骨基因骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和骨钙素(BGP)mRNA的表达情况。3、建立小鼠背部皮肤压疮动物模型,随机分三组:nASCs移植组、dASCs移植组及PBS组(对照组,NC),每组8只。取增殖期的第三代细胞,用病毒包被好的绿色荧光蛋白(GFP)进行细胞转染标记细胞后,分别于每个压疮周边及基底部多点注射1×10~6个相应细胞,PBS组注射同等体积的PBS,观察创面的愈合情况。分别于注射后11天、21天分批处死小鼠后切取压疮创面组织行HE染色和Masson染色,观察创面组织炎症细胞浸润程度、表皮厚度及胶原蛋白沉积情况;进行CD31及S100免疫组化染色观察创面血管及神经细胞再生情况;第11天取创面组织行冰冻包埋切片追踪两种细胞在创面中的定植及存活情况。结果:1、成功从正常与糖尿病患者脂肪组织中分离提取出ASCs,原代接种8小时后可见贴壁细胞,传代后细胞生长明显加速;两种第3代细胞外形均一,多呈长梭形,呈放射样旋涡状生长,形态无明显区别。流式细胞仪检测两种第三代细胞CD90、CD105、CD73、CD44均呈阳性表达,CD34均呈阴性表达。2、MTT法检测细胞增殖能力结果显示nASCs增殖能力较dASCs强,生长速度较快;诱导分化结果显示nASCs与dASCs均可被诱导成脂及成骨,其中dASCs成脂能力强于nASCs,但成骨能力低于nASCs。实时定量PCR结果显示诱导后dASCs脂肪特有基因PPAR-γmRNA的表达水平高于nASCs,而成骨基因骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和骨钙素(BGP)mRNA的表达水平低于nASCs,差异均具有统计学意义(P0.001)。3、成功建立小鼠背部皮肤压疮模型;行细胞移植后第5、9、13天nASCs组的创面愈合率分别为36.47±5.83%、89.18±2.14%、99.47±0.89%,dASCs组的为35.66±6.52%、60.40±7.67%、87.18±2.56,PBS组的为19.89±7.20%、46.32±4.21%、66.25±5.26%,nASCs组创面愈合最快,dASCs组愈合速度次之,PBS组创面愈合最慢。第11天取创面组织行HE染色结果显示nASCs组开始出现上皮化,而dASCs组与PBS组创面表面痂皮与基底组织分离;在nASCs组、dASCs组及PBS组中炎性细胞浸润程度依次递减,组间差异具有统计学意义(P0.001)。第21天,炎性细胞浸润程度在三组中无明显区别;表皮厚度在nASCs组、dASCs组和PBS组依次递减,组间差距具有统计学意义(P0.05);三组中创面周边均可见再生的毛囊,其中dASCs创面中央可见新生毛囊。马松染色结果显示,第11天,dASCs组(48.38±1.36%)胶原沉积比nASCs组(45.85±1.95%)多,但无统计学意义;dASCs组和nASCs组胶原沉积明显大于PBS组(41.46±1.75%),差异有统计学意义(P0.001)。第21天,nASCs组(56.93±1.67%)、dASCs组(54.17±1.71%)与PBS组(50.34±1.29%)胶原沉积依次递减,组间差异均具有统计学意义(P0.05)。CD31免疫组化结果显示,第11天,nASCs组(17.80±0.84)的血管数目与dASCs组(17.20±1.30)无显著差别;但两者血管数目均明显大于PBS组(8.00±1.41),差异具有统计学意义(P0.001)。第21天,血管数目在nASCs组(20.00±1.87)、dASCs组(18.00±2.12)及PBS组(14.00±1.58)中依次递减,各组间差异均具有统计学意义(P0.05)。S100免疫组化结果显示,第11天,nASCs组与dASCs组均未见阳性显色细胞;第21天,nASCs组(1.63±0.08)的雪旺氏细胞密度小于dASCs组(1.76±0.12),但无统计学意义;nASCs组和dASCs组均明显大于PBS组(0.55±0.04),差异具有统计学意义(P0.001)。创面细胞追踪结果为,第11天后nASCs与dASCs均可定植于创面皮肤内。结论:1.和nASCs相比,dASCs的形态和表面标志无明显变化,其增殖和成骨分化能力下降,而成脂分化能力增加。2.dASCs局部移植可通过调节局部炎症、增加胶原沉积、促进血管新生和神经再生促进压疮创面愈合。3.dASCs局部移植仍具备促进创面愈合的能力,但其能力较nASCs减小。
【图文】：

旋涡状,荧光显微镜,细胞形态,细胞

遵义医学院硕士学位论文姚远镇2 结果2.1 ASCs 的的形态成功从正常与糖尿病患者脂肪组织中分离出 ASCs，原代接种 8 小时候可见贴壁细胞，48 小时换液后贴壁细胞形态不一；后细胞生长速度加快，大多细胞逐渐伸展成长梭形，细胞 9-10 天融合可达 80%-90%。传代后细胞生长明显加速，5 天左右即可再次传代。两组第 3 代细胞外形均一，多呈长梭形，呈放射样旋涡状生长，形态无明显区别。如图 1。

生长曲线,流式,鉴定结果,阴性

图 2 第三代 nASCs 与 dASCs 流式鉴定结果两组细胞的 CD90、CD105、CD73、CD44 均呈阳性表达，CD34 均呈阴性表达。2.3 ASCs 的增殖能力采用 MTT 法检测第 3 代细胞增殖能力并绘制生长曲线，结果显示 nASCs 增殖能力较 dASCs 强，，生长速度较快。第 3 天前两组细胞均处于生长停滞期，第 3 天到第 6天细胞处于对数增长期，但 nASCs 曲线斜率更大，第 6 天后逐渐进入平台期。在相应的时间点中，dASCs 的 OD 值均比 nASCs 的低。如图 3。
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2

【参考文献】