PKCζ介导高脂引发CD36向细胞膜转位的分子机制研究

发布时间：2020-06-13 04:49

【摘要】：目的:脂肪酸转运蛋白CD36对骨骼肌细胞摄取脂肪酸具有重要的促进和调控功能。但过量的脂肪酸供应会导致CD36在细胞膜上长期驻留,使细胞对脂肪酸的摄取增加,最终引发胰岛素抵抗。但是脂肪酸诱导CD36转位的机制还不清楚。本课题将以高脂饮食喂养的C57小鼠和棕榈酸诱导的L6骨骼肌细胞为模型,探讨在高脂条件下,骨骼肌细胞中调控CD36转位的分子机制。本课题的实施有助于我们进一步了解血脂异常导致胰岛素抵抗的发病机理,并可为药物开发与干涉治疗提供有价值的靶点。方法:通过高脂喂养C57小鼠和含有棕榈酸(PA)的培养基处理L6骨骼肌细胞,确定胰岛素抵抗发生的时间点;使用细胞膜蛋白分离方法分析蛋白在细胞膜上的分布情况;以荧光标记的能量底物检测细胞在不同条件下对葡萄糖和脂肪酸的摄取;通过化学阻断剂和shRNA转染研究相关蛋白的功能及相关激酶的上下游关系;以免疫荧光方法检测组织及细胞中蛋白的分布以及细胞骨架的形态变化;通过Western-blot检测组织和细胞中相关蛋白的表达、活性及分布。结果:高脂在引发胰岛素抵抗之前就可增加脂肪酸转运蛋白CD36在细胞膜上的分布。CD36结合细胞外的脂肪酸后可抑制细胞内Fyn的活性,导致LKB1由细胞核转移到细胞质中,激活位于细胞质中的AMPK。在PA引发的信号通路中,AMPK位于PKCζ上游并可激活PKCζ。活化后的PKCζ调控actin的结构,使之发生actin结构重塑,进而促进CD36向膜迁移。上膜后的CD36会介导细胞摄取更多的脂肪酸。本研究揭示了高脂通过CD36-Fyn-LKB1-AMPK-PKCζ-actin信号通路传导,使更多的CD36迁移到细胞膜上的分子机制。
【图文】：

小鼠,胰岛素抵抗,高脂饮食

高脂饲料喂养 C57 小鼠，对照组以正常饲料喂养。每隔两周测定体重，进行口服葡萄糖耐量测试（OGTT），处死正常饮食组（NCD）和高脂饮食组（HFD）的老鼠，取血液测定血脂水平，取肌肉组织固定（用于形态学观察）或者液氮冷冻（用于蛋白检测）。随着时间的推移，检测高脂饮食引起小鼠葡萄糖耐受性降低情况，确定高脂喂养可导致小鼠糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗发生以及出现病理变化所对应的时间点。3.1.1高脂喂养小鼠胰岛素抵抗时间确定高脂喂养 C57 小鼠两个月，对小鼠进行 OGTT 检测。实验结果显示，对照组与高脂组 OGTT 结果没有差异，说明糖耐量没有损伤，胰岛素抵抗尚未形成。高脂喂养 C5小鼠四个月，对小鼠进行 OGTT 检测的结果显示，高脂喂养组 OGTT 与对照组出现显著性差异，并且空腹血糖明显升高，超过了 11 mmol/L。说明出现了糖耐量损伤，胰岛素抵抗形成。

血脂,小鼠,骨骼肌,脂肪酸

图 2 小鼠血脂相关指标检测结果。（a）自由脂肪酸检测；(b)甘油三酯检测；(c) 总胆固醇检测。n=10，*p<0.05，**p<0.01，#p<0.05 vs NCD 2Mon，，##p<0.01 vs NCD 2Mon。3.1.3小鼠发生胰岛素抵抗之前骨骼肌中脂肪酸摄取相关蛋白检测取正常（NCD）及高脂（HFD）喂养小鼠两个月的后腿骨骼肌，匀浆后 Western-blot检测总蛋白，同时分离、检测细胞膜蛋白。实验结果显示，与正常喂养组做比较，高脂喂养组骨骼肌细胞膜上 CD36 分布显著增加，而 GLUT4 在细胞膜上的分布没有变化，说明肌细胞对脂肪酸的摄取增加了。另外，PKCζ 和 AMPK 的活性显著增加，Akt 的活性没有变化。
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2

【参考文献】