miR-146a在胸腺增龄性萎缩中调控胸腺基质细胞凋亡的相关研究

发布时间：2020-06-14 15:05

【摘要】：目的:胸腺是产生自我限制和自身耐受的功能性T淋巴细胞的主要淋巴器官。来自骨髓的淋巴造血祖细胞在此分化发育成成熟的T淋巴细胞。为了维持能够支持胸腺细胞正常分化的微环境,需要胸腺细胞和胸腺微环境之间复杂的相互作用。研究表明胸腺基质微环境的破坏在胸腺增龄性萎缩中发挥重要作用,胸腺的增龄性萎缩很大程度上是由胸腺基质细胞的首先改变引起的。大量的研究表明miRNA在胸腺及胸腺内T淋巴细胞的发育过程中发挥重要作用,例如miRNA的表达异常可以破坏胸腺微环境并且引起T淋巴细胞发育障碍。与年龄相关的胸腺上皮细胞质量下降趋势与miRNA的表达变化之间存在相关性,其中miR-146a随胸腺老化而表达下降的趋势是最明显的。可以推测这种表达降低与胸腺微环境破坏及胸腺萎缩之间存在某种联系。在本次实验中,我们通过过表达小鼠胸腺基质细胞中的miR-146a,观察其对其下游多个基因的蛋白翻译水平及胸腺基质细胞凋亡率的影响,试图在一定程度上分析miR-146a随年龄下降对胸腺增龄性萎缩的影响及其产生机制。研究方法:1、胸腺基质细胞培养和鉴定:取胸腺后对胸腺基质细胞进行分离纯化培养,使用DMEM/F12培养液培养细胞一周左右后,消化收集细胞进行流式细胞鉴定。2、模拟物过表达胸腺基质细胞中miR-146a含量:使用miR-146a模拟物及阴性对照试剂在lipomax介导下分别转染实验组及对照组胸腺基质细胞。48小时后,分别提取小RNA进行RT-PCR检测miR-146a表达量。3、TRAF-6蛋白,Smad4蛋白及Bcl-2蛋白浓度检测:使用lipomax转染miR-146a模拟物72小时后,分别提取实验组及对照组的胸腺基质细胞蛋白,进行western blot检测细胞中TRAF-6蛋白,Smad4蛋白及Bcl-2蛋白。4、胸腺基质细胞凋亡相关检测:转染miR-146a模拟物72小时后,分别提取实验组及对照组的细胞培养液,使用Mouse IL-6Valukine~(TM) ELISA试剂测其中的IL-6含量,并且分别消化收集实验组与对照组细胞,使用流式细胞术检测胸腺基质细胞凋亡率。结果:1、胸腺基质细胞培养和鉴定:流式细胞仪鉴定结构显示,90%以上的细胞(90.78±0.428)%为CD45~-的胸腺基质细胞,不到10%(9.22±0.428)%为CD45~+的淋巴细胞。2、模拟物过表达胸腺基质细胞中miR-146a含量:lipomax转染miR-146a模拟物48小时后,转染组细胞中miR-146a表达相对对照组明显升高。其中转染组miR-146a相对对照组含量为192.948±54.636,差异具有统计学意义(P0.05)。3、TRAF-6蛋白及Smad4蛋白浓度随miR-146a升高而下降:lipomax转染miR-146a模拟物72小时后,转染组细胞中TRAF-6蛋白表达相对对照组明显降低。其中转染组TRAF-6蛋白相对对照组含量为0.496±0.254,差异具有统计学意义(P0.05)。Smad4蛋白相对对照组含量为0.377±0.103,差异具有统计学意义(P0.01)。4、IL-6含量随miR-146a升高而下降:lipomax转染miR-146a模拟物72小时后,转染组细胞培养液中的IL-6明显降低。其中转染组为1536.843±528.624pg/ml,对照组为7150.165±724.098pg/ml,差异具有统计学意义(P0.01)。5、过表达miR-146a72小时后胸腺基质细胞凋亡率较对照组减低:lipomax转染miR-146a模拟物72小时后,转染组细胞中Bcl-2蛋白表达相对对照组明显增高。其中转染组相对对照组含量为2.430±0.292,差异具有统计学意义(P0.01)。转染组细胞的凋亡率相对对照组有所减低,其中转染组的凋亡率为(13.9±1.842)%,对照组为(22.833±3.435)%,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:1、胸腺基质细胞中的TRAF-6蛋白及Smad4蛋白的表达可以被miR-146a所抑制。2、miR-146a可以抑制胸腺基质细胞中IL-6的分泌。3、miR-146a可以增高胸腺基质细胞中Bcl-2蛋白的表达并一定程度上抑制胸腺基质细胞的凋亡。综上可以考虑在增龄性萎缩的胸腺中,miR-146a可以通过对其靶基因TRAF-6蛋白及Smad4蛋白的调节来影响Bcl-2蛋白的表达及胸腺基质细胞的凋亡。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R583
【图文】：

中国医科大学硕士学位论文3 结果3.1 胸腺基质细胞的培养及鉴定取胸腺后对胸腺基质细胞进行分离纯化培养，使用 DMEM/F12 培养一周左右后，消化收集细胞进行流式细胞鉴定。流式细胞仪鉴定结果显上的细胞（90.78±0.428）%为 CD45-的胸腺基质细胞，不到 10%（9.22为 CD45+的淋巴细胞。（见图 1）A

中国医科大学硕士学位论文在相关性，其中 miR-146a 随年龄的增加表达降低，并且其降为了分析不同含量 miR-146a 对胸腺基质细胞的影响，使用 m对照试剂在 lipomax 介导下分别转染实验组及对照组胸腺基max 转染 miR-146a 模拟物 48 小时后，分别提取小 RNA 进行 R到转染组细胞中 miR-146a 表达相对对照组明显升高。其中转量为 192.948±54.636，对照组为 1，差异具有统计学意义（

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本文编号：2712955