老年血液通过CCL11加速年轻小鼠骨量丢失的研究

发布时间：2020-06-15 02:15

【摘要】：研究背景和目的:衰老作为一个全身性的事件,不仅以孤立的方式影响着某个组织或器官,其对骨骼系统也产生不利的影响。骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种骨量减低,骨结构破坏导致骨脆性增加因而易发生骨折的全身性疾病。原发性骨质疏松症包括绝经后骨质疏松症、老年骨质疏松症和特发性骨质疏松症。和衰老相关的骨质疏松症主要指老年性骨质疏松症。抗衰老治疗能够增加小鼠骨小梁量及骨组织生物机械特性,因此,我们有理由相信,抗衰老是治疗老年性骨质疏松症的一种有效方法。长久以来,人们一直在研究延缓衰老以达到长生不老的方法。有研究报道:年轻个体的血液、血浆及他们的衍生物能够促进干细胞功能及组织的再生和修复,因此其能够对抗衰老过程。而通过联体共生/血浆注射实现两只动物的血液交换对于衰老/抗衰老的研究具有十分重要的作用。研究表明,异时联体共生/年轻血浆注射能够对抗衰老的不利影响,对于对抗老年性骨质疏松症具有积极的作用;反之,异时联体共生/老年血浆注射能够对年轻动物的组织产生不利的影响。因此,我们推测,在动物体内是否存在某种/某些关键的因子,其随着年龄的增长而改变,通过调节这种或这些因子能够影响骨质疏松症的发生发展进程。本课题旨在探讨老年血浆是否能够影响小鼠的骨骼“衰老”,进一步研究其中关键的分子及其对于骨质疏松症的意义。研究方法:本研究分三部分进行:第一部分观察异时联体共生/老年血浆注射对年轻小鼠的骨量影响。联体共生实验共分为三个组,分别为年轻小鼠与年轻小鼠共生组,年轻小鼠与老年小鼠共生组,假共生组,在共生模型建立后4周,于一只小鼠尾静脉注射Evan染液,通过观察Evan染液向与其共生小鼠渗透情况,确认联体共生模型是否成功;共生后正常饲养3个月。血浆注射实验分为三个组,分别为注射年轻血浆组,注射老年血浆组,注射生理盐水组,提取18月老年雄性及3月年轻雄性C57小鼠血液、常规离心后收集血浆,将血浆对3月龄年轻C57小鼠进行尾静脉注射,每周2次,每次0.2 ml,共注射8周,另外设置一组即对3月龄年轻C57小鼠尾静脉注射生理盐水,每周2次,每次0.2 ml。用MICROCT、HE染色、TRAP染色和VONCOSSA染色等方法观察几组动物模型中小鼠的骨量丢失及成骨和破骨情况。第二部分筛选影响骨质丢失的关键分子。通过定制蛋白芯片分析联体共生/老年血浆注射两种模型,分别筛选各自的关键分子,交叉得到CCL11、CXCL1、IL-13、CCL5四种关键分子。然后进行验证实验,实验分为五组:注射老年血浆组、注射老年血浆+CCL11抗体组、注射老年血浆+CXCL1抗体组、注射老年血浆+IL-13抗体组、注射老年血浆+CCL5抗体组,每周注射2次,每次0.2 ml老年血浆,抗体注入时,每周1次,每次0.1 ml,共注射8周。用MICROCT、HE染色的方法观察几组动物模型中小鼠的骨量丢失的情况。最后得出CCL11效果最强的初步结论。第三部分探讨CCL11与年轻和老年小鼠骨量丢失的关系。本实验分为六组:年轻小鼠组、年轻小鼠注射CCL11组、年轻小鼠注射CCL11+CCL11抗体组、老年小鼠组、老年小鼠注射CCL11组、老年小鼠注射CCL11+CCL11抗体组,每周2次,每次0.1 ml CCL11重构体,CCL11抗体注入时,每周2次,每次0.1 ml,共注射8周。用MICROCT、HE染色、TRAP染色和VONCOSSA染色等方法观察几组动物模型中小鼠的骨量丢失及成骨和破骨情况。结果:第一部分:在联体共生模型中,年轻与老年小鼠共生组年轻小鼠在BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.area上明显低于其余两组(年轻小鼠与年轻小鼠共生组,假共生组);N.ob/B.Pm及P1NP(骨形成指标)较其余两组减低;N.Oc/B.Pm及CTX(骨吸收指标)较其余两组增高。在血浆注射模型中我们观察到注射老年血浆的年轻小鼠在BMD、BV\TV、Tb.N、Tb.area上明显低于其余两组(注射年轻血浆的年轻小鼠,注射生理盐水的年轻小鼠),且N.ob/B.Pm及P1NP较其余两组减低,而N.Oc/B.Pm及CTX较其余两组增高。这些结果提示:老年血液和血浆确实可加速小鼠骨质和骨量的丢失。第二部分:我们发现,注射老年血浆+CCL11抗体的年轻小鼠BMD、BV\TV、Tb.N、Tb.area比注射老年血浆组明显增高;而注射老年血浆+CXCL1抗体组、注射老年血浆+IL-13抗体组、注射老年血浆+CCL5抗体组比注射老年血浆组在上述指标上无明显差异。结果提示:CCL11可能是老年血浆可以加速年轻小鼠骨质和骨量丢失的关键。第三部分:我们发现,对于年轻小鼠来说,CCL11注射组在BMD、BV/TV、Tb/N、Tb.area较年轻小鼠组和年轻小鼠注射CCL11+CCL11抗体组两组均明显减低,N.ob/B.Pm、P1NP均明显减低,而N.Oc/B.Pm,CTX指标明显增高;同样对于老年小鼠,CCL11注射组较其余两组(老年小鼠组和老年小鼠注射CCL11+CCL11抗体组)在BMD、BV/TV、Tb/N、Tb.area明显减低,在N.ob/B.Pm、P1NP明显减低,而在N.Oc/B.Pm和CTX上,三组间无明显差异。结果提示:CCL11确实可以加速年轻和老年小鼠的骨质和骨量的丢失,成骨细胞功能下降可能是关键原因之一。结论:1、在异时联体共生模型中,年轻小鼠和同种属老年小鼠共生后,导致年轻小鼠骨量丢失;在血浆注射模型中,对年轻小鼠注射老年血浆后促进年轻小鼠的骨量丢失。2、在联体共生模型和血浆注射模型中共同升高的因子为CCL11、CXCL1、IL-13、CCL5;而其中CCL11为影响骨量丢失的关键因子。3、CCL11注射后能引起年轻小鼠和老年小鼠的骨量丢失,且CCL11被CCL11抗体抑制后这种加速骨量丢失的效应消失。总之,老年血浆能够加速年轻小鼠的骨量丢失,这种作用可能是通过血浆中高浓度的CCL11实现的。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R580
【图文】：

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2-14 周）血浆，方法简述如下：使用左手将待采血小鼠固定后，右手精棉球对小鼠眶周皮肤消毒 2 次，消毒完毕后，左手拇指与食指轻压使小鼠眶后静脉丛充血，右手持内径 0.5 mm 的玻璃毛细管自眼内眦刺约 2-3 mm，当遇到阻力时，停止，同时，缓慢将针退出约 0.1-0.5 mm毛细管使出血顺畅。血液采集完成后，将所采集血液置于含有抗凝剂（中，放于温箱中 37 ℃ 静置半个小时，使用离心机 5000 rpm，离心 1清液，将上清液置于 -80 ℃ 冰箱中冷冻保存。采取尾静脉注射的方式将 C57 小鼠尾静脉置于 50 ℃ 水中浸润 20 秒钟后，将其固定在小鼠用食指和中指于小鼠尾巴近端稍用力加压，而用拇指和环指于小鼠尾巴定，使用酒精棉球自小鼠尾巴近端向远端环状加压涂抹 2 次，将小鼠鼠尾的末端，右手持 1 ml 注射器使针头方向与鼠尾巴方向平行顺血管针洞朝上缓慢推进，当看到回血后，注射）分别对 B1、 B2、 B3 组盐水、老年血浆、年轻血浆 8 周，每周 2 次，每次 0.2 ml；注射全月，处死小鼠取股骨送检。

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图 2 共生模型 MICROCT 和 HE 染色骨参数分析结果注射实验中， B2 组年轻小鼠（对年轻小鼠注射老年血浆）较射生理盐水）B3 组（对年轻小鼠注射年轻血浆）BMD、BV/减低（图 3 ）。

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