PAD酶参与CIA小鼠肺损伤诱发类风湿关节炎的可能机制及青藤碱的作用

发布时间：2020-06-17 06:29

【摘要】：背景:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种自身免疫性疾病,以慢性滑膜炎为主要病理改变,可以被划分为ACPA+和ACPA-两大类,ACPA+的RA患者与特定的HLA II类等位基因相关。基因突变只能解释不到20%的ACPA+的RA易感性,对于ACPA-RA贡献率更低。环境是重要的诱发因素。抗瓜氨酸化蛋白的免疫反应早于RA关节炎症状的出现。在PAD催化下的瓜氨酸化反应为ACPA产生提供了抗原,这一反应可能在肺、牙龈与肠道发生,其中肺的作用尤其重要。目的:通过理论研究寻找从肺论治RA的中医以及现代医学理论与实践依据;通过临床研究验证肺损伤在RA发病中的可能作用;通过动物实验进一步验证肺损伤是否能够通过激活PAD酶促进瓜氨酸化蛋白的产生进而诱发RA,以及青藤碱是否可以通过抑制PAD酶的活性抑制瓜氨酸化蛋白产生进而抑制或减缓RA发生发展进程。方法:第一部分理论研究采用文献综述的方式,获取中医传统文献以及现代医学的研究成果,对从肺论治RA的理论与实践依据进行综述分析;第二部分临床研究采用回顾性研究方法,选取在2014年1月-2017年1月之间因不可解释的呼吸系统异常接受检查的符合条件的ACPA阳性个体46例,符合RA分类标准,发病时间小于1年的RA患者24例,以及ACPA阴性对照个体32例,对3组个体进行胸部CT的影像学评估。第三部分动物实验,将30只雄性DBA/1小鼠随机分为2组,一组5只作为空白对照组,另一组25只造模,小鼠分别于d0、d 21尾根部注射免疫II胶原乳剂,诱导CIA小鼠模型。选取造模成功的15只在d24天再次随机分成3组:模型组(n=5);氯脒组(n=5);中药组(n=5),加上空白对照组(n=5)共4组。d28开始给药。给药14天后处死小鼠。主要观察小鼠关节炎指数,滑膜病理改变,肺病理改变,肺PAD-2、PAD-4以及瓜氨酸化蛋白免疫组化、Western Blot蛋白检测及PAD-2、PAD-4 mRNA表达。同时观察Th1相关细胞因子TNF-α,IL-6以及Th2相关细胞因子IL-4和IL-10的变化。结果:1、第一部分理论研究结果,传统中医学对肺与关节之间的关系认识有比较丰富的经验,通过五脏中肺在体合皮,肺主皮毛,肺主气司呼吸等认识,将肺与痹证联系起来。现代医学研究表明肺作为RA可能的发病部位,通过多种触发因素(特别是吸烟)导致遗传易感个体免疫耐受破坏导致RA触发,这其中PAD酶及其产物瓜氨酸化蛋白是重要的关键环节。2、第二部分临床研究结果,无论肺实质病变还是气道异常均呈现ACPA阳性人群大于ACPA阴性对照人群的特点(52%versus 19%肺实质病变;52%versus 19%气道异常;两者P=0.003)。肺纤维化只发生于ACPA阳性个体(6[13%]of 46)。肺实质病变出现在ACPA阳性和早期RA患者中(52%versus 38%;P=0.243)。两组出现气道受累的比例有差别但无统计学意义(52%versus 67%;P=0.245)。纵隔淋巴结肿大在ACPA阳性人群中明显多于ACPA阴性人群(19%versus 0,P=0.033)。3、第三部分动物实验结果,d 24至d42,模型组的AI评分较空白组明显升高,差异有统计学意义(P0.01)。初次免疫后d 24至d 42,中药组的AI评分与模型组比较呈下降趋势,但无显著统计学差异;d 39至d 39,氯脒组AI评分较模型组显著降低,差异有统计学意义(d36P0.05,d39P0.01)。空白组滑膜细胞约1-2层,分布整齐,未见明显炎性细胞浸润;模型组滑膜细胞多呈5-10层排列,可见大量中性粒细胞和单核淋巴细胞浸润;氯脒组和中药组滑膜细胞增生改善,炎性细胞浸润改善。模型组组血清TNF-α水平较空白组显著升高,差异有统计学意义(P0.01);与模型组比较,中药组血清TNF-α水平明显降低,差异有统计学意义(P0.01);模型组血清IL-6水平较空白组明显升高,差异有统计学意义(P0.01);与模型组组比较,氯脒组和中药组血清IL-6水平显著降低,差异有统计学意义(P0.01)。模型组组血清IL-4水平较空白组显著升高,差异有统计学意义(P0.01);与模型组比较,中药组血清IL-4水平明显升高,差异有统计学意义(P0.01);模型组血清IL-10水平较空白组明显升高,差异有统计学意义(P0.01);与模型组组比较,氯脒组和中药组血清IL-10水平显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。正常肺组织肺泡间隔比较均匀,约2个红细胞厚度,结构均匀清晰,肺泡内无渗出,偶见淋巴细胞和巨噬细胞浸润在支气管和血管周围及肺泡间隔。经胶原和佐剂诱导的模型组(见图7-2)小鼠肺部出现炎症表现,肺泡内有浆液性渗出,间质性炎症改变,肺泡内有渗出肺泡间隔增宽变厚,结构模糊,在支气管和血管周围大量淋巴、巨噬细胞浸润。治疗组(见图7-3和图7-4)肺炎表现减轻,肺泡间隔稍有增宽,淋巴细胞和巨噬细胞少量。与空白组比较,模型组PAD-2、PAD-4和peptidyl-citrulline免疫组化染色明显增强,灰度值明显升高,差异有统计学意义(PAD-4的P0.05,PAD-2和peptidyl-citruIline的P0.01);与模型组比较,氯脒组和中药组PAD-2和peptidyl-citrulline表达明显减弱,灰度值明显下调,差异有统计学意义(中药组PAD-2的P0.05,其他P0.01);与模型组相比,氯脒组和中药组的PAD-4均呈下降趋势,但无统计学差异。与空白组比较,模型组PAD-2、PAD-4和peptidyl-citrulline蛋白表达明显增强,相对灰度值明显升高,差异有统计学意义(P0.01);与模型组比较,氯脒组和中药组PAD-2、PAD-4和peptidyl-citrulline蛋白表达表达明显减弱,相对灰度值明显下调,差异有统计学意义(P0.01)。与空白组比较,模型组PAD-2、PAD-4 mRNA表达明显增高,差异有统计学意义(P0.01);与模型组比较,氯脒组和中药组PAD-2、PAD-4 mRNA表达显著降低,差异有统计学意义(P0.01)。PCR扩增曲线和溶解曲线表明内参与目的基因扩增效率一致,扩增产物单一,实验结果可靠。结论:1、理论研究结果表明,痹证发生与肺有密切关系;肺是RA发生的一个可能的重要起始部位,肺诱导RA发生与局部PAD酶及其瓜氨酸化蛋白产物增加有关。2、临床研究结果表明,肺的实质病变和气道异常是一种炎症状态,瓜氨酸化蛋白诱导产生的ACPA阳性人群中肺部异常人群比例更高,提示肺部炎症可能是RA的一个可能诱发因素。3、动物实验结果表明,胶原诱导的佐剂性关节炎小鼠同时存在肺炎与关节炎表现,通过抑制肺炎局部PAD-2和PAD-4两种酶的产生可以减轻小鼠模型的关节炎症状并减轻肺炎表现,同时降低Th1相关炎症细胞因子分泌,升高Th2相关细胞因子分泌。青藤碱可能通过抑制PAD-2和PAD-4酶进而抑制肺炎局部瓜氨酸化蛋白的产生,从而减轻模型小鼠关节炎症,发挥治疗作用。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R593.22
【图文】：

阶段,患病率,关节损伤,瓜氨酸

南京中医药大学博士学位论文．１邋／－逦—＊—逡逑刖邋Ｓ逡逑类风湿关节炎（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ邋ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＲＡ）是一种自身免疫性疾病，以慢性滑膜要病理改变，临床表现为关节疼痛肿胀、关节损伤和活动受限，最终会导致关节残疾。一项关于中低收入国家ＲＡ患病率的研究显示，男性ＲＡ的患病率为０．１６％（９０．１１－０．２０％），女性达到邋０．７５％（９５％ＣＩ：０．６０－０．９０％）ｍ。以抗瓜氨酸化抗体（ＡＣＰＡ阳性来划分，ＲＡ可以被划分为ＡＣＰＡ＋和ＡＣＰＡ－两大类［２］。ＡＣＰＡ＋的ＲＡ患者与ＨＬＡ邋ＩＩ类等位基因相关。多项全基因组关联分析（ＧＷＡＳ）己经确认遗传变异群体中均与ＲＡ发病相关联。但是，这些突变只能解释不到２０％的ＡＣＰＡ＋的Ｒ性，对于ＡＣＰＡ－ＲＡ贡献率更低。环境诱发因素是重要的环境风险因素，在ＲＡ至关重要［３］。逡逑

瓜氨酸

图２：瓜氨酸化蛋白在ＲＡ发病中的作用逡逑Ｆｉｇ邋２：邋Ｔｈｅ邋Ｒｏｌｅ邋ｏｆ邋Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋Ｉｎ邋Ｔｈｅ邋Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＲＡ逡逑触发因素可能主要与环境暴露有关。已知吸烟、硅尘、有机溶剂均与ＡＣＰＡ阳患者密切相关［４］。环境暴露和ＨＬＡ突变相互作用，共同导致ＲＡ发生。通过遗传学研究，在肺和齿龈发现了被瓜氨酸化的转录后修饰蛋白，可能是自身免疫的重发因素。吸烟和其他因素可能触发瓜氨酸化（通过肽基精氨酸转亚胺基酶，ＰＡＤｓ）生一系列自身抗原＆６］，进而诱导类淋巴组织形成，增强抗原呈递和Ｔ、Ｂ淋巴细胞。免疫系统如何对抗瓜氨酸化蛋白，又如何与其他免疫反应相关联，比如ＲＦ的产生甲酰自身抗体的产生等等，以及为什么主要影响关节，都需要进一步研究。有不究发现携带ＡＣＰＡ的正常人常年没有发展成ＲＡｍ。在什么条件下ＡＣＰＡ可以触发ＲＡ些人可能发展成为ＲＡ。这些问题可能与人体天然免疫和适应性免疫有关。ＨＬＡ相免疫对瓜氨酸化和其他转录后修饰抗原在其中发挥重要作用。逡逑在血液中检测到ＲＡ［８］相关抗体要早于关节炎的发生［９］，并且与粘膜损伤密切相

【参考文献】