Graves病患者血清外泌体通过Toll样受体介导免疫和炎症反应

发布时间：2020-06-18 18:12

【摘要】：目的:1、探讨Graves病患者血清来源外泌体(Exosome,exo)与正常人血清来源的外泌体是否存在质和量的差异。2、探究Graves病患者分泌的外泌体,是否与树突细胞的TLR2或TLR3结合,促进炎症反应。方法:本研究选取2016年至2019年于中国医科大学附属第一医院门诊就诊的初发Graves病患者26例(3名男性,23名女性),炎症活动期未进行激素冲击的Graves眼病(Graves ophthalmopathy,GO)患者7例(5名男性,2名女性)。从社区人群选取年龄、性别、BMI大致匹配的健康志愿者作为患者的对照组。抽取患者与对照组自愿者血液离心得到血清,分别使用试剂盒与超速离心机两种方法提取exo。首先使用蛋白免疫印迹方法(Western blot,WB)检测外泌体标志物CD63的表达,透射电镜分析其形态,外泌体浓度粒径分析其大小及浓度,对提取的外泌体进行鉴定;BCA试剂盒法来测定外泌体的浓度,评估初发Graves病、炎症活动期未进行激素冲击GO患者与对照组相比血清来源外泌体浓度有无差异;Western blot检测外泌体中甲状腺的特异性抗原。对患者血液中TRAb与血清来源外泌体中IGF-1R、HSP60、TPO蛋白水平进行相关性分析;初发Graves病患者与对照组自愿者血清通过超速离心方法提取的外泌体与健康人来源外周血单核细胞(PBMC)共培养24h,共聚焦显微镜检测外泌体与Toll样受体在细胞的定位情况。流式染色细胞分析CD11c+TLR2+、CD11c+TLR3+的表达情况。ELISA检测细胞上清中炎症因子IL-1β、IL-6的表达情况。结果:(1)通过两种方法(试剂盒、超速离心法)获取的直径在30-150nm的扁圆型微泡,同时表达外泌体标志蛋白CD63,可鉴定为外泌体。(2)Graves病患者、炎症活动期未进行激素冲击GO患者、健康志愿者血清来源外泌体浓度上无差异。(3)对Graves病组患者、炎症活动期未进行激素冲击GO患者与健康志愿者血清来源外泌体进行WB蛋白组分分析,结果显示Graves病患者、炎症活动期未进行激素冲击GO患者中外泌体IGF-1R、TPO、HSP60表达明显高于对照组,TSHR在三组间无明显差异。患者血液中TRAb与血清来源外泌体中IGF-1R表达存在显著正相关。(4)共聚焦显微镜显示荧光标记的外泌体可被细胞摄取,与Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)共同表达在PBMC细胞上。(5)Graves病患者与健康人血清来源外泌体与健康志愿者来源的PBMC共培养24h,细胞流式分析显示Graves病患者血清外泌体促进CD11c+TLR2+、CD11c+TLR3+表达增高;(6)共培养24h的Graves病组细胞上清中细胞因子(IL-6、IL-1β)水平明显高于对照组结论:(1)Graves病组、未进行激素冲击GO患者组与对照组比较,血清外泌体浓度无明显差异,但蛋白组分IGF-1R、TPO和HSP60表达增高;(2)Graves病患者血清外泌体促进PBMC中CD11c+TLR2+、CD11c+TLR3+表达增高,HSP60是TLR2的配体,HSP60表达增高,推测外泌体中HSP60可能与树突细胞中TLR2结合,刺激PBMC分泌炎症因子(IL-6、IL-1β),可促进炎症反应的发生。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R581
【图文】：

外泌体在适应性免疫发挥作用机制（ZhangBetal.FrontiersinImmunology,2014,5:518）

图 3 NTA 测量外泌体的大小与浓度注：峰值在 30-100nm 以内，单峰，96.9%粒子径在 87.8nm 附近，峰值浓度在 2.7×106particles/ml3.2.2 超速离心方法提取外泌体电镜观察结果

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本文编号：2719640