AWRK6促胰岛素分泌和抑制Min6细胞凋亡的功能和分子机制

发布时间：2020-06-18 05:19

【摘要】：慢性疾病糖尿病(DM)是一组以慢性血液葡糖水平增高为特征的代谢疾病症候群,其主要发病机制与胰岛素分泌和/或作用缺陷所引发的血糖升高有关,在其发病前期,因靶器官敏感程度导致其胰岛素含量相对不足;在其发病后期,因胰岛细胞受损而导致胰岛素含量绝对不足。治疗这种疾病的关键在于促进胰岛素分泌和抑制胰岛细胞凋亡;因此,许多DM的治疗药物均以治疗胰岛β细胞,使其恢复正常的生物学功能为主。AWRK6(SWVGKHGKKFGLKKHKKH)是本实验室分离于东北林蛙表皮、并改良而成的一种新型的生物活性肽,既能够促进Min6细胞对胰岛素的分泌又能够抑制相应细胞的凋亡,这些特性均已经在本实验室的前期相关研究中得到相应验证,本研究对相应功能的机制进行进一步探讨。为探究AWRK6促胰岛素分泌分子机制,本实验用带有荧光标签的AWRK6处理Min6细胞,并观察其作用位置;运用Elisa方法检测AWRK6处理GLP-1R基因沉默型Min6细胞的胰岛素分泌量,以分析其作用受体;分别用Epac2抑制剂和PKA抑制剂处理Min6细胞后,再用AWRK6处理并检测其胰岛素分泌量,探究AWRK6促胰岛素分泌的可能信号通路。为探究AWRK6抑制细胞凋亡的功能及其分子机制,本实验运用流式细胞术对Min6细胞存活率进行了检测;利用Western Blotting检测了磷酸型和裂解型Caspase-9和Caspase-3的含量;利用Elisa检测Caspase-12、Caspase-9和Caspase-3的活性;而后,利用Western Blotting检测Akt的磷酸化程度,并利用Akt抑制剂,检测AWRK6处理的Min6细胞存活率和Caspase-9的活性。实验结果表明,带有荧光标签的AWRK6与Min6细胞作用后,绿色荧光位于细胞膜表面;AWRK6能显著促进Min6细胞分泌胰岛素(P0.01),但会被Ex-9显著抑制(P0.01);GLP-1R被沉默后,AWRK6不能促进Min6细胞的胰岛素分泌;Epac抑制剂和PKA抑制剂处理后,AWRK6的促胰岛素功能被显著抑制,差异显著性分别为P0.01和P0.05。AWRK6能显著抑制内质网应激诱发的Min6细胞凋亡(P0.01);能显著增加Caspase-9和Caspase-3的磷酸化水平(P0.01)并显著降低其裂解型含量(P0.01);AWRK6能够显著降低Caspase-12、Caspase-9和Caspase-3的活性(P0.01)。此外,AWRK6能够显著促进Akt的磷酸化水平(P0.01);在Akt抑制剂处理后,AWRK6的抑制细胞凋亡的功能被显著抑制(P0.01),抑制Caspase活性的功能也显著降低(P0.01)。根据实验结果,可以得到以下实验结论:1.AWRK6可能作为一种GLP-1受体激动剂来发挥其促胰岛素分泌的功能,其相关分子机制可能是通过GLP-1R/cAMP/Epac信号通路来发挥作用。2.AWRK6可以通过抑制Caspase家族的活性来缓解由内质网应激诱发的细胞凋亡。其相关分子机制是通过Akt使Caspase-9被磷酸化,从而抑制其生物学活性,进而抑制细胞凋亡。
【学位授予单位】：辽宁大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.1
【图文】：

信号通路,细胞系,胰岛细胞

图 1-1 内质网应激下游信号通路（摘自 CST Guide，有岛杂交瘤细胞 Min6外实验发展较为迅速，其原因之一是对各种细胞应体内环境，能够大幅度增加研究的效率。相关来进行，通过用药物处理，探究 ERS 与糖尿病反映出胰岛细胞的基本功能的细胞系包括 RIN IT 细胞系[27]、βHC 细胞系[28]、MIN 细胞系[29]和是 Min6 胰岛细胞系。胞基本能够反应出胰岛细胞的相应生物学功能：素,而且内质网应激相关的大部分基因能在 Min为促进胰岛素分泌的信号之一，其信号的产生主究选取的研究对象为 Min6 细胞，其特点为生长验操作较为方便，鉴于以上条件，我们选择 M

促胰岛素,荧光检测

AWRK6促胰岛素分泌水平

【参考文献】