MnTMPyP对百草枯致肺上皮细胞损伤的保护作用及机制研究

发布时间：2020-06-19 06:38

【摘要】：1前言百草枯(Paraquat,PQ),一种高效的吡啶类触杀型高效除草剂,化学分子为1,1'-二甲基-4,4'-联吡啶阳离子盐,。自1960年以来,在全世界范围内农业领域得到了广泛使用。即使摄入少量PQ,也会对人类和动物产生很强的毒性,由于缺乏强有效解毒药物,中毒后致死率非常高。特别是在发展中国家居中的亚洲,每年大约有数千人在使用PQ意外中毒或服用后中毒,其死亡率在60-70%之间。肺脏是PQ中毒的主要靶器官。PQ在肺部聚集,引起肺的水肿、出血和渗出,炎性浸润肺间质和肺泡,成纤维细胞增殖和过多的胶原蛋白沉积,肺上皮细胞及支气管上皮细胞的损伤最终导致肺纤维化。中毒后患者的典型表现为“百草枯肺”,中毒早期主要表现为急性呼吸窘迫综合征(ARDS),后期会发生不可逆性的肺间质纤维化,最终,患者多死于呼吸衰竭。目前,PQ中毒引起肺损伤的确切机制尚不完全清楚。但大多数研究证实PQ诱导的氧化还原反应产生大量的氧自由基,是肺损伤的重要原因。大量活性氧(ROS)氧化不同生物膜上的不饱和脂肪酸,引发内质网(ER)应激和细胞凋亡级联,进一步引起肺损伤。近年来,很多研究针对减少ROS的生成、清除生成的ROS以及减少炎症反应等方面。但是,上述治疗效果仍不能降低高死亡率。因此,迫切需要寻找有效的治疗方法。超氧化物歧化酶(SOD)减少氧化应激起到保护作用在近几年被广泛报道,然而其在PQ诱导的肺损伤模型中的报道较少。研究表明,PQ诱导的氧化应激和细胞内线粒体通透性增加导致锰-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的失活和活力下降。锰(Ⅲ)-四(4-N-甲基吡啶基)卟啉(MnTMPyP),是超氧化物歧化酶的一种模拟产物,可穿透细胞并有效清除细胞内超氧化物离子。MnTMPyP抑制脂多糖诱导的自由基产生和多巴胺能神经变性。在缺血-再灌注肾损伤模型中,MnTMPyP通过清除产生的自由基有效降低促凋亡蛋白Bax的表达,从而抑制了Caspase-3的活化。本文的目的是探讨MnTMPyP是否减轻PQ诱导氧化应激损伤肺上皮细胞的损伤以及机制研究。2材料与方法2.1实验材料细胞株:人肺上皮样细胞-A549。2.2实验分组2.2.1 PQ诱导A549细胞凋亡与内质网应激与线粒体凋亡途径相关指标的检测实验分组:对照组(等量培养基)、MnTMPyP 10μM组、PQ 750μM组、PQ+MnTMPyP组,各组细胞处理24h后,检测相关指标。2.2.2 MnTMPyP通过抑制线粒体凋亡途径减弱PQ诱导的A549细胞凋亡实验分组:对照组(等量培养基)、MnTMPyP 10μM组、PQ 750μM组、PQ+MnTMPyP组,各组细胞处理24h后,检测相关指标。2.2.3 MnTMPyP通过抑制内质网应激途径减弱PQ诱导的A549细胞凋亡实验分组:对照组(等量培养基)、MnTMPyP 10μM组、PQ 750μM组、PQ+MnTMPyP组,各组细胞处理24h后,检测相关指标。2.3主要研究方法2.3.1建立PQ诱导A549细胞凋亡模型与线粒体凋亡途径的相关指标检测(1)A549细胞培养及PQ处理细胞。(2)MnTMPyP预处理A549细胞。(3)MTT法检测A549细胞活性。(4)使用罗丹明(Rh)123染色后,在倒置荧光显微镜下观察A549细胞线粒体膜电位荧光强度;以及使用流式细胞仪检测Rh 123染色后的细胞线粒体荧光强度。(5)Annexin V检测试剂盒检测A549细胞凋亡率。(6)使用Caspase-3活性检测试剂盒检测百草枯诱导A549细胞的Caspase-3活性。(7)活性氧检测试剂盒DCFH-DA染色后,在倒置荧光显微镜下观察A549细胞内活性氧荧光强度;以及使用流式细胞仪检测DCFH-DA染色后的细胞内活性氧水平。(8)Fluo-3/AM法检测细胞内Ca~(2+)水平。(9)谷胱甘肽还原酶检测试剂盒检测细胞内谷胱甘肽还原酶活性。(10)Western blot检测Bcl-2、Bax、Grp78、CHOP、β-actin蛋白表达量的变化。2.3.2 MnTMPyP通过抑制活性氧诱导的线粒体凋亡途径,从而减弱PQ诱导的A549细胞凋亡(1)用MnTMPyP预处理,并检测线粒体膜电位、凋亡率、细胞内活性氧和Caspase-3活性。(2)使用MnTMPyP预处理,Western blot检测Bax、Bcl-2、β-actin蛋白表达量的变化。2.3.3 MnTMPyP通过抑制活性氧诱导的内质网应激途径,并减弱PQ诱导的A549细胞的凋亡(1)使用MnTMPyP预处理,并检测细胞内活性氧、Ca~(2+)水平、谷胱甘肽还原酶活性检测。(2)使用MnTMPyP预处理,Western blot检测Grp78、CHOP、β-actin蛋白表达量的变化。3结果3.1 PQ诱导的A549细胞凋亡模型与线粒体凋亡途径相关的指标检测(1)PQ对A549细胞具有显著的细胞毒性,显著降低细胞活力。(2)MnTMPyP预处理A549细胞后细胞活性较PQ组显著增加。(3)使用Rh123染色后,荧光显微镜下观察A549细胞线粒体膜电位荧光强度;通过流式细胞术测量细胞的线粒体荧光强度,结果显示PQ组线粒体膜电位荧光强度较对照组显著下降。(4)Annexin V检测凋亡率,发现PQ组细胞凋亡率明显高于对照组。(5)通过Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3活性,结果显示PQ组Caspase-3活性较对照组增高显著。(6)DCFH-DA染色后,荧光导致显微镜下观察A549细胞内活性氧的荧光强度,并使用流式细胞术检测细胞内活性氧水平,结果显示PQ组细胞内活性氧水平显著高于对照组。(7)Fluo-3/AM法检测细胞内Ca~(2+)水平,结果显示PQ组细胞内Ca~(2+)水平显著高于对照组。(8)细胞内谷胱甘肽还原酶(GR)活性检测,结果显示PQ组细胞内谷胱甘肽还原酶活性较对照组显著降低。(9)Western blot蛋白检测结果显示,与对照组相比,PQ组较Bcl-2蛋白表达显著下降,Bax、Grp78、CHOP蛋白表达显著增强。3.2 MnTMPyP通过抑制线粒体凋亡途径减弱PQ诱导的A549细胞凋亡(1)MnTMPyP预处理,显著降低了PQ诱导细胞凋亡率以及对线粒体膜电位的破坏,减少了活性氧的生成及抑制了Caspase-3的活性。(2)使用MnTMPyP预处理,Western blot检测结果显示,抑制凋亡蛋白Bcl-2表达量显著增加,促进凋亡蛋白BAX表达量显著降低。3.3 MnTMPyP通过抑制活性氧引发的内质网应激途径,减弱PQ诱导A549细胞凋亡(1)使用MnTMPyP预处理,显著降低了PQ诱导的细胞内Ca~(2+)水平,细胞内谷胱甘肽活性显著检测。(2)使用MnTMPyP预处理,Western blotting检测结果显示,内质网应激标志性蛋白Grp78、CHOP表达量较PQ组显著下降。4结论(1)PQ通过诱导氧化应激激发线粒体凋亡途径激发A549细胞凋亡。(2)PQ通过诱导氧化应激并激发内质网应激途径引起A549细胞凋亡。(3)MnTMPyP通过抑制氧化应激并缓解线粒体凋亡途径而减少A549细胞凋亡。(4)MnTMPyP通过抑制氧化应激并缓解内质网应激途径而减少A549细胞凋亡。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R595.4
【图文】：

细胞活性,细胞,处理水平,对照组

图 1 各组细胞处理 24 h 后 MTT 法检测的细胞活性。数据以 x±s**P <0.01，PQ 组与对照组比较；##P<0.01，与 PQ 组相比。3.1.2 MnTMPyP 减少 PQ 诱导的 A549 细胞内 ROS 生成按不同处理因素处理A549细胞24 h后，DCFH-DA法检测与对照组相比，MnTMPyP组ROS稍增加，但差异无统计学意组ROS显著增加（P<0.01）；与PQ组相比，PQ+MnTMPyP处理水平显著降低（P<0.01），表明MnTMPyP预处理有效减少A成。见图2。A.

细胞,细胞质内,对照组,流式细胞仪检测

10B.图2 各组细胞处理24 h后DCFH-DA法检测细胞内ROS 水平。A.流式细胞仪检测ROS。B.荧光显微镜检测 ROS 荧光强度(×400)。数据以 x±s 表示，独立重复 3 次：**P <0.01，PQ组与对照组比较；##P<0.01，与 PQ 组相比。3.1.3 MnTMPyP 降低 PQ 诱导的 A549 细胞内的 Ca2+水平对照组和 MnTMPyP 组细胞质内 Ca2+无明显升高(P>0.05)，与对照组相比，PQ 组 Ca2+水平显著升高(P<0.01)；与 PQ 组相比，PQ+MnTMPyP 组 Ca2+水平明显降低(P<0.01)，表明 MnTMPyP 预处理显著降低 PQ 处理的细胞内 Ca2+水平。见图 3。图3 各组细胞处理24 h后细胞质内Ca2+水平。数据以 x±s表示，独立重复3次：**P <0.01

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