miR-146a及其靶mRNAs与Graves病相关性研究

发布时间：2020-06-19 22:25

【摘要】：背景:Graves病(GD)是除I型糖尿病外最常见的自身免疫紊乱性内分泌疾病,也是成人持续甲状腺机能亢进最常见的原因,严重者可因诱发甲状腺危象、甲亢心等导致死亡。由于目前GD的病因和发病机制尚未完全阐明,目前尚不能针对其病因进行治疗,故GD复发率高;因此有必要进一步探索GD的病因和发病机制。微小RNA-146a(miR-146a)是一种新型的真核生物基因和免疫调控因子,可通过差异性表达以及直接降低其靶mRNAs的表达量或抑制其翻译成蛋白质而参与多种自身免疫性疾病的发病机制。外周血单个核细胞(PBMCs)是免疫应答的主要效应细胞,明确miR-146a及其潜在免疫相关性靶mRNAs在GD患者PBMCs中的表达情况有利于进一步探索GD的发病机制。目的:探讨miR-146a及其免疫相关性靶mRNAs在GD患者PBMCs中的表达情况及临床意义。方法:1.收集30例初发GD患者、28例治疗期GD患者、31例缓解期GD患者和26例健康志愿者的清晨空腹EDTA-K2抗凝静脉血,密度梯度离心法分离纯化得到PBMCs,Trizol法提取PBMCs中的总RNAs。采用加poly(A)尾法和常规逆转录方法分别将总RNAs中的miRNAs和mRNAs逆转录成相应的cDNA,再采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测PBMCs中miR-146a及其免疫相关性靶mRNAs的相对表达量,并与各临床因子进行相关性分析。miR-146a免疫相关性靶mRNAs包括白介素-8(IL-8)、白介素1受体相关激酶1/2(IRAK1/2)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、CC趋化因子配体5/8(CCL5/CCL8)和Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)的mRNAs。2.采用SPSS24.0对数据进行统计分析。符合正态分布的连续性计量资料以?x?s表示;符合偏态分布的连续性计量资料以M(P25,P75)表示。所用统计学方法包括t检验、t'检验、Mann-Whitney U检验、kruskal-wallis 1-way ANOVA检验、?~2检验以及Spearman相关分析。所有检验均认为P0.05有统计学意义。应用GraPhPad Prism 5作图。结果:1.GD初诊组和GD治疗组的PBMCs中,miR146a的表达水平均显著低于健康对照组和GD缓解组(P0.05);IL-8和CCL8的mRNA的表达水平与之呈现显著相反的变化趋势(P0.05)。2.GD缓解组与健康对照组的PBMCs中,miR-146以及IL-8和CCL8的mRNAs的表达量均无显著统计学差异(P0.05)。3.相较于GD初诊组,GD治疗组的PBMCs中IL-8的mRNAs的表达量降低(P0.05),而miR146a以及CCL8的mRNA的表达量无显著统计学差异(P0.05)。4.相较于健康对照组,GD初诊组的PBMCs中CCL5和TRAF6的mRNAs的表达量显著降低(P0.05),IRAK1、IRAK2和FADD的mRNAs的表达量无统计学差异(P0.05)。5.PBMCs中的miR-146a表达水平与IL-8、CCL8的mRNAs的表达水平呈显著负相关(r=-0.294,r=-0.298,P0.05),与血清总三碘甲状腺原氨酸(TT3)、总甲状腺素(TT4)、总三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)和促甲状腺激素受体抗体(TRAb)水平呈负相关(r=-0.343,r=-0.347,r=-0.374,r=-0.409,r=-0.302,P0.01),且与血清促甲状腺激素(TSH)水平呈正相关(r=0.391,P0.01)。6.PBMCs中的IL-8的mRNA表达水平与血清TSH水平呈负相关(r=-0.549,P0.01),与TT3、TT4、FT3、FT4和TRAb水平呈正相关(r=0.552,r=0.529,r=0.591,r=0.602,r=0.464,P0.01)。7.PBMCs中的CCL8的mRNA表达水平与TSH水平呈负相关(r=-0.325,P0.01),与TT3、FT3、FT4和TRAb水平呈正相关(r=0.215,r=0.217,r=0.215,r=0.370,P0.05),但与TT4表达表达水平无显著相关性(P0.05)。结论:PBMCs中的miR-146a与GD密切相关,其可能通过抑制其靶基因IL-8和CCL8的mRNAs的表达而在GD的发病机制中发挥作用,其表达水平可以作为预测GD疾病状态的辅助生物检验学指标,未来也可能成为治疗GD的生物学靶点。
【学位授予单位】：湖北医药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R581.1
【图文】：

图 3.1 各组间甲状腺功能及 TRAb 水平比较注：（1）HC（健康对照组）；nGD(GD 初诊组)；tGD(GD 治疗组)；eGD(GD 缓解组);（2） A~F 分别为血清 TSH、TT3、TT4、FT3、FT4 和 TRAb 水平；（3）各组间比较，*表示 P＜0.05，**表示 P<0.01。2. miR-146a 及其靶 mRNAs 的 real-time PCR 熔点曲线结果qRT-PCR 结束后，在 60~95 C 对 miR-146a 及其免疫相关性靶 mRNAs 的扩增产物进行溶解曲线分析以判断引物特异性。结果显示各扩增产物均在特定温度显示唯一的单峰，未出现二聚体，说明各引物具有良好的特异性，符合相对荧光定量 PCR 检测要求。（表 3.2，图 3.2）表 3.2 miR-146a 及其靶 mRNAs 的扩增产物的溶解温度（Tm 值）名称 Tm 值（ C） 名称 Tm 值（ C） 名称 Tm值（ C） 名称 Tm 值（ C）U6 80.32 miR-146a 77.69 -actin 86.68 IL-8 82.38IRAK1 88.31 IRAK2 84.66 TRAF6 82.30 FADD 85.04

图 3.2 miR-146a 及其免疫相关性靶 mRNAs 熔点曲线结果A~J 分别为 U6、miR-146a 以及 -actin、IL-8、IRAK1、IRAK2、TRAF6、FAD 的 mRNAs 的熔点曲线结果由图可知，各扩增产物均在特定温度显示唯一的单峰，说明各引物具有良 qRT-PCR 相对定量检测标准。-146a 及其靶 mRNAs 的相对表达水平比较及相关性分 HC 组相比，nGD 组患者 PBMCs 中的 miR-146a 以及 TRAF6 和 s 的相对表达量显著下降（P<0.01）；IL-8 和 CCL8 的 mRNAs 的表达（P<0.05）；IRAK1、IRAK2 及 FADD 的 mRNAs 的表达水平则无显（P>0.05）。（表 3.3，图 3.3）于 miR-146a 与 IL-8 和 CCL-8 的 mRNAs 的相对表达水平趋势相反pearman 相关性分析。结果显示，miR-146a 表达水平与 IL-8 的 mR呈显著负相关（r=-0.294，P=0.029<0.05），与 CCL8 的 mRNA 的表相关性（r=-0.298，P=0.032<0.05）。

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本文编号：2721421