邻苯三酚和单宁酸对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
发布时间：2020-06-22 09:32
【摘要】：目的2型糖尿病的发病率逐年上升且有年轻化的趋势,α-葡萄糖苷酶抑制剂与2型糖尿病的治疗息息相关,如何有效防治慢性病的发生发展成为公共卫生领域研究的一个热点。环境中一些含酚类化合物在慢性病的防治中可能具有应用价值。邻苯三酚和单宁酸是环境中广泛存在的多酚类有机化合物:邻苯三酚可抑制乳腺导管癌原位扩散和癌细胞增值、抗感染、诱导肺癌细胞凋亡等;单宁酸具有抗氧化、抗神经炎症、缓解阿尔茨海默症、延缓糖尿病肾病等作用。据以往报道证实,它们可抑制多种酶活性,但对α-葡萄糖苷酶(α-GC)的活性抑制机制尚且不明。此外,其工业生产废水也会对环境造成一定污染,因此,有效利用含酚废水显得十分重要。本实验采用酶抑制动力学与计算机模拟相结合的方法探讨邻苯三酚和单宁酸分别对α-GC活性抑制及其结构功能的影响,有助于帮助人们了解酚类物质对α-GC的活性抑制机制,为2型糖尿病开发新的药物研究提供一些新的理论方向和依据。方法本实验方法主要有:(1)分别测量不同浓度的邻苯三酚和单宁酸对α-GC的活性影响;(2)评估邻苯三酚和单宁酸是否可逆性抑制α-GC以及抑制类型;(3)不同的作用时间下测定不同浓度的邻苯三酚和单宁酸对酶的活性影响;(4)采用内源荧光法和ANS结合荧光分析该酶的构象及其表面疏水性的变化;(5)利用分子动力学和计算机模拟对接法来预测该酶三维立体结构以及邻苯三酚和单宁酸分别和α-GC相结合的位点及其相关残基。结果邻苯三酚以一种可逆的且相对紧密的方式与α-GC结合,呈典型的混合型抑制,评估其IC50=0.72±0.051 mM,Kl=0.37±0.018mM,其介导的酶失活没有显著的时间动力学过程。内源荧光及ANS结合荧光分析表明邻苯三酚能诱导α-GC的三级结构变化,与酶活性丧失有关(K=2.98±0.41 mM-1;n=11.01±0.09)。邻苯三酚与α-GC活性中心的残基(ASP68、MET69、TYR71、PHE157、PHE158、PHE177、GLN181、HIS348、ASP349、ASP406、VAL407、ASP408、ARG439和ARG443)相互作用。单宁酸能够快速地、部分可逆的抑制α-GC活性,属于一种斜率-抛物线性的混合型抑制类型,评估IC50=1.21±0.03 μM和Kl=0.41-±±0.032 μM,其介导的酶失活能够迅速发生而没有显著的时间动力学过程。单宁酸诱导α-GC的部分区域结构变化而不是整体的构象变化,且不引起疏水表面暴露(K=0.42±0.44μM-1;n=1.89±0.11)。单宁酸与α-GC活性中心附近的残基(MET69、TYR71、PHE177、ARG212、ASP214、GLU276、HIS348、ASP349和ARG439)相互作用。结论邻苯三酚和单宁酸均能抑制α-GC的活性,且单宁酸抑制作用更强,其抑制机制分别是典型的纯混合型和斜率-抛物线性混合型抑制。并且邻苯三酚诱导α-GC整体结构变化;单宁酸诱导α-GC部分区域性结构变化。邻苯三酚和单宁酸与α-GC活性中心附近的残基相互作用,它们结构中的酚羟基在配体结合和抑制机理中起重要作用。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.1
【图文】：
逡逑更为有趣的是，在图３－１Ａ条件下继续增大邻苯三酚的浓度，ａ－ＧＣ不会完逡逑全失活（图３－１Ｃ），这就意味着Ｅ－Ｉ－Ｓ复合物已形成了一个稳定状态。即使在高逡逑剂量的邻苯三酚作用下，ｃｔ－ＧＣ也能维持其很低的残留催化活性。逡逑Ａ邋１逡逑Ｓ邋Ｉ逡逑？？Ｓ逦６0－逦￡逡逑Ｉ邋４0－邋＼逡逑Ｉ８逡逑０逦２逦４逦６逦８逦１０逡逑Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ邋（ｍＭ）逡逑Ｂ邋ｍｔ逡逑＾邋８0－邋＼逡逑色邋＼逡逑安邋６０－逡逑卜逡逑？邋２0－逡逑０逦２０逦４０逦６０逦８０逦１００逡逑Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ邋（ｍＭ）逡逑ｃ邋１００＇逡逑８０－逡逑ｇ逡逑Ｃ＇邋６０－逡逑１逡逑＾逦４０－逡逑１邋Ｊ逡逑逦ｍ逦■逦■逦■逡逑0逦ｙ／．逦，逦，逦，逦，逦，逦逡逑０逦１０逦２０逦３０逦４０逦５０逡逑Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ邋（ｍＭ）逡逑图３－１不同浓度邻苯三酚对ｃｔ－ＧＣ的抑制作用。（Ａ）底物体系存在邻苯三酚。（Ｂ）底物逡逑
如果它是不可逆的抑制，则抑制剂曲线与控制直线应是相同的斜率，并且逡逑在与酶量相当的位置与横轴（［Ｅ］）相交。逡逑图３－２中的数据证实了邻苯三酚与ｃｔ－ＧＣ的可逆性结合，与图３－１中所预测逡逑的结果一致。逡逑丨Ｄ逡逑０．００逦０．０５逦０．１０逦０．１５逦０．２０逦０．２５逦０．３０逦０．３５逡逑［Ｅ］邋（ｎｇ／ｍｌ）逡逑图３－２不同浓度邻苯三酚作用下，ａ－ＧＣ活力ｖ与酶浓度［Ｅ］的比较曲线图。邻苯三酚浓度逡逑从上到下分别为邋０邋ｍＭ邋（■）、０．２５邋ｍＭ邋（|r）、０．５邋ｍＭ邋（▲）、０．７５邋ｍＭ邋（%迹ⅲ保靛澹恚湾澹ㄥ澹浚ｅ义鲜笛樘跫迹常薄ｅ义希疲椋纾常插澹茫铮恚穑幔颍椋螅铮铄澹铮驽澹幔牵缅澹幔悖簦椋觯椋簦澹鲥澹鳎椋簦桢澹澹睿恚邋澹悖铮睿悖澹睿簦颍幔簦椋铮铄澹郏牛蒎澹酰睿洌澹蝈澹洌椋妫妫澹颍澹睿翦义希常插义
本文编号：2725540
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.1
【图文】：
逡逑更为有趣的是，在图３－１Ａ条件下继续增大邻苯三酚的浓度，ａ－ＧＣ不会完逡逑全失活（图３－１Ｃ），这就意味着Ｅ－Ｉ－Ｓ复合物已形成了一个稳定状态。即使在高逡逑剂量的邻苯三酚作用下，ｃｔ－ＧＣ也能维持其很低的残留催化活性。逡逑Ａ邋１逡逑Ｓ邋Ｉ逡逑？？Ｓ逦６0－逦￡逡逑Ｉ邋４0－邋＼逡逑Ｉ８逡逑０逦２逦４逦６逦８逦１０逡逑Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ邋（ｍＭ）逡逑Ｂ邋ｍｔ逡逑＾邋８0－邋＼逡逑色邋＼逡逑安邋６０－逡逑卜逡逑？邋２0－逡逑０逦２０逦４０逦６０逦８０逦１００逡逑Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ邋（ｍＭ）逡逑ｃ邋１００＇逡逑８０－逡逑ｇ逡逑Ｃ＇邋６０－逡逑１逡逑＾逦４０－逡逑１邋Ｊ逡逑逦ｍ逦■逦■逦■逡逑0逦ｙ／．逦，逦，逦，逦，逦，逦逡逑０逦１０逦２０逦３０逦４０逦５０逡逑Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ邋（ｍＭ）逡逑图３－１不同浓度邻苯三酚对ｃｔ－ＧＣ的抑制作用。（Ａ）底物体系存在邻苯三酚。（Ｂ）底物逡逑
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本文编号：2725540
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