MYDGF对2型糖尿病小鼠肠道L细胞分泌GLP-1的影响及机制研究

发布时间：2020-06-22 09:37

【摘要】：研究背景糖尿病(DM)是一种代谢性疾病,存在胰岛素分泌障碍和/或作用缺陷,以葡萄糖、蛋白质及脂肪代谢障碍为特征的一种慢性病,而β细胞功能减退是2型糖尿病进展的主要原因。胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是小肠内分泌细胞分泌的一种激素,由肠道L细胞分泌,可调节胰岛素对摄食的反应,不仅能增加胰岛素分泌量,同时也对胰高血糖素有抑制作用,并且还能刺激β细胞,使其增殖、分化及抑制其凋亡。髓源性生长因子(myeloid-derived growth factor,MYDGF)是一种新型骨髓源性分泌蛋白,由骨髓细胞产生。在测试重组蛋白对血清饥饿的培养的新生大鼠心室肌细胞的细胞保护作用中发现,MYDGF的细胞保护作用与AKT的磷酸化和细胞凋亡的抑制有关。此外,外源性添加的MYDGF通过MEK信号通路促进人冠状动脉内皮细胞的增殖。基因敲除MYDGF的小鼠具有较大的梗塞瘢痕和减少的细胞增殖和血管生成;在缺血和再灌注后,正常骨髓的移植或重组MYDGF的补充可以逆转这种效应。以上研究提示,MYDGF作为一种新型蛋白可能在心血管疾病治疗领域具有良好的应用前景。如上所述,MYDGF可以激活MEK信号通路,而MEK信号通路在GLP-1的合成与产生中也具有十分重要的作用,因此,我们猜想MYDGF是否可以通过激活MEK信号通路从而促进GLP-1的分泌,最终降低糖尿病患者的血糖水平。研究目的本研究的目的是探索MYDGF对2型糖尿病小鼠肠道L细胞合成和分泌GLP-1的作用及潜在机制。方法我们委托上海南方模型生物技术有限公司使用C57BL/6小鼠为原型制作MYDGF-/-小鼠模型,使其交配以获得同窝野生型和MYDGF-/-小鼠。将4周大的雄性SPF级C57BL/6背景MYDGF-/-小鼠及野生型小鼠,先高脂饮食喂养4周,再注射链脲佐菌素(STZ),以模拟2型糖尿病。体内实验,我们用2型糖尿病小鼠模型进行相关研究,通过基因敲除减少循环中的MYDGF水平和外源性补充MYDGF,观察MYDGF对小鼠肠道L细胞分泌GLP-1的影响及机制。第一部分,探索MYDGF敲除对小鼠肠道L细胞分泌GLP-1的影响。每周在固定时间测定各组小鼠的体重、摄食量以及空腹血糖。实验结束时,各组随机挑选小鼠完善腹腔葡萄糖耐量实验(IPGTT)及胰岛素耐量实验(ITT),ELISA法检测血清各代谢指标水平;RT-PCR分析GLP-1原位基因gcg、、pc3的表达情况。取回肠组织免疫荧光分析肠道L细胞数量的变化情况。Western blot检测GLP-1蛋白的表达情况。第二部分,探索外源性增加MYDGF对小鼠肠道L细胞分泌GLP-1的影响,我们通过尾静脉注射AAV-MYDGF使小鼠体内过表达MYDGF。干预之前,行腹腔葡萄糖耐量实验(IPGTT)及胰岛素耐量实验(ITT),干预后,每周在固定时间测定各组小鼠的摄食量、体重及空腹血糖,干预6周后,再次检测IPGTT和ITT,ELISA法检测血清各代谢指标水平;RT-PCR分析GLP-1原位基因gcg、、pc3的表达情况。取回肠组织免疫荧光分析肠道L细胞数量的变化情况。Western blot检测相关信号蛋白表达的情况。第三部分,探索MYDGF对GLP-1的作用机制。我们利用siRNA/PKA和siRNA/MEK进行干扰,检测各组小鼠GLP-1的含量和蛋白质表达情况,并检测相关信号通路的信号蛋白表达水平。体外实验,我们选择STC-1细胞进行实验。第一部分,研究MYDGF对STC-1细胞分泌GLP-1的影响。通过外源性补充重组MYDGF蛋白,检测上清液及细胞中GLP-1的含量。第二部分,利用siRNA/PKA和siRNA/MEK进行干扰,检测各组细胞GLP-1分泌和表达情况,并检测相关信号通路的信号蛋白表达水平。结果在体内实验中,我们发现,增加或减少循环内的MYDGF水平不影响非糖尿病小鼠的糖脂代谢。但是MYDGF缺乏时,糖尿病小鼠空腹血糖、HbA1c明显升高,循环内GLP-1含量明显降低,回肠gcg,pc3表达减弱。而外源性补充后可使空腹血糖和HbA1c有所降低,也可增加循环内GLP-1水平。补充MYDGF也可改善糖耐量,增加空腹及注射葡萄糖30min后的血浆胰岛素水平,上调GLP-1原位基因gcg、、pc3的表达。体外实验表明,MYDGF可以增加STC-1细胞GLP-1的分泌量,也可以增加gcg,pc3的表达。机制方面,补充MYDGF可显著升高P-ERK1/2表达水平,同时,也可升高P-PKA、P-GSK3β,促进β-catenin的核转位。结论综上所述,本研究首次证实MYDGF可能通过激活MEK/ERK信号通路及PKA/GSK3β/β-catenin信号通路促进GLP-1分泌,从而使糖尿病小鼠的糖脂代谢水平得以改善。MYDGF可能在肠道L细胞分泌GLP-1的过程中扮演重要角色,这就为寻找糖尿病的预防及治疗开辟了新的道路。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.1
【图文】：

肠ＧＬＰ－１相关基因ｇｃｇ、ｐｃ３的表达无明显影响（Ｐ＞０＿０５）。与非糖尿病组相比，ＷＴ逡逑和Ｋ０糖尿病组小鼠回肠ＧＬＰ－１相关基因ｇｃｇ、ｐｃ３的表达明显下降，其中ＷＴ糖尿逡逑病小鼠的下降水平少低于Ｋ０糖尿病组（图１－７，ＰＣ０．０５）。给ＷＴ和Ｋ０糖尿病组逡逑小鼠外源性补充ＡＡＶ－ＭＹＤＧＦ后，与ＡＡＶ－ＧＦＰ组相比，回肠ＧＬＰ－１相关基因ｇｃｇ、逡逑２１逡逑

Ａ：邋ＭＥＫ／ＥＲＫ信号通路蛋白表达量；Ｂ：各组小鼠ＧＬＰ－１分泌量；Ｃ：各组小鼠活性ＧＬＰ－１逡逑分泌量＊Ｐ＜０．０５与ｓｉＣｏｎ组比较逡逑图３－２邋ｓｉＲＮＡ／ＭＥＫ可以抑制ＭＹＤＧＦ的作用逡逑Ｆｉｇ邋３－２邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＭＹＤＧＦ邋ｗａｓ邋ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ邋ｂｙ邋ｓｉＲＮＡ／ＭＥＫ邋ｉｎ邋ｄｉａｂｅｔｉｃ邋ｍｉｃｅ逡逑３．５．２邋ＭＹＤＧＦ邋可激活邋ＰＫＡ／ＧＳＫ３ｐ／ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ邋信号通路逡逑免疫印迹结果显示，与非糖尿病小鼠（ｃｏｎｔｒｏｌ）相比，糖尿病小鼠ＰＫＡ，邋ＧＳＫ－３ｐ逡逑蛋白磷酸化水平明显减少，胞浆Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ磷酸化水平增加，胞核ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ水平减少。逡逑其中ＫＯ糖尿病小鼠较ＷＴ糖尿病小鼠ＰＫＡ，ＧＳＫ－３Ｐ蛋白磷酸化水平更低，胞核逡逑Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ水平更低。采用ＡＡＶ－ＭＹＤＧＦ干预后，ＷＴ和ＫＯ糖尿病小鼠回肠ＰＫＡ，逡逑ＧＳＫ－３Ｐ蛋白a愃峄�水平均升高，胞團ｐ－ｃａｔｅｎｉｎa愃峄�水平较少，胞核ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ水平逡逑增加，差异有统计学差异（Ｐ�

本文编号：2725544