Ⅱ型糖尿病相关的中心体扩增的分子机制研究

发布时间：2020-06-24 21:50

【摘要】：Ⅱ型糖尿病(T2DM)是严重影响身体健康、对家庭经济造成多重影响的一种慢性疾病。当前越来越多的证据表明,T2DM可以增加患癌的风险及癌症差的预后。然而,人们对T2DM与癌症之间的生物学联系,和T2DM引发癌症的分子机制还知之甚少。中心体扩增已被证实是肿瘤的特征之一,并且中心体扩增可以诱导癌症的发生,增加肿瘤细胞的侵袭能力。同时,也与较差的癌症预后相关。可是,关于T2DM是否通过中心体扩增而引发癌症的研究,截至目前为止尚未见报道;而且T2DM是否引起中心体扩增,以及造成中心体扩增的分子机制研究也不清楚。本学位论文研究了体外模拟T2DM的病理生理条件,使用功能蛋白质组学、分子生物学和细胞生物学相关技术与手段,寻找T2DM引起中心体扩增的相关蛋白分子以及相关信号通路。验证了在脑胶质瘤细胞中,同样发生了中心体扩增,并且与脑胶质瘤的分期相关。研究内容包含以下四个部分:第一部分:利用功能蛋白质组学方法研究Ⅱ型糖尿病引起中心体扩增的分子机制。最近研究报道,在结直肠癌HCT116细胞株中,T2DM通过增强ROCK1/14-3-3σ复合体的表达、绑定和中心体移位来促进中心体扩增。使用功能蛋白质组学研究策略,利用HCT116细胞,进一步研究了中心体扩增的分子信号通路。以未处理的HCT116细胞为对照组,高糖、高脂、高胰岛素的体外模拟T2DM的病理生理条件的HCT116细胞为处理组。使用免疫荧光法检测了两种类型组别细胞中心体的扩增情况。结果显示,在处理组细胞中,发生了中度(3-5个)中心体扩增;使用2-DE方法分析了两种类型组别细胞的蛋白差异点。结果显示,与对照组相比,处理组出现了9个差异蛋白,其中7个上调,2个下调;用多肽指纹图谱法鉴定了9个蛋白的身份。蛋白免疫印迹法检测了NPM、PCNA和14-3-3σ的蛋白表达,结果和2-DE的相符。进一步使用免疫荧光和蛋白质免疫印迹法,检测了NPM、PCNA和14-3-3σ之间的相关性。结果显示,NPM独自引起中心体扩增,PCNA通过ROCK1调控中心体扩增。以上研究表明,在高糖、高脂、高胰岛素的条件下,NPM活性增加可以诱导中心体扩增;同时PCNA和14-3-3σ表达增强,增强了中心体的扩增。第二部分:JNK1/Stat3信号通路负向调控中心体扩增。中心体扩增可以诱导癌症的发生,增加肿瘤细胞的侵袭能力。那么,是否存在在T2DM的病理生理条件下的负向调控机制呢?鉴于此,使用蛋白质免疫印迹法,检测了对照组和处理组两组细胞中JNK1和Stat3活性情况。结果显示,在高糖、高脂、高胰岛素条件下,JNK1和Stat3活性均被激活;通过JNK1和Stat3的沉默实验发现,在处理组中,两个蛋白被敲低之后均上调了中心体的扩增;此外,构建了pcDNA3.1(+)-JNK1的真核表达载体,转染细胞后发现,处理组中JNK1的过表达下调了中心体的扩增;同时,使用蛋白质免疫印迹法,检测了JNK1和Stat3上下游之间的关系发现,JNK1是Stat3的上游效应分子;进一步研究发现,JNK1和Stat3均影响了14-3-3σ的表达,从而影响中心体扩增。以上研究表明,高糖、高脂、高胰岛素激活了JNK1-Stat3的信号通路,调控了下游效应分子14-3-3σ,从而调控了细胞的中心体扩增,为进一步的癌症预防奠定了理论基础。第三部分:Hsp74/14-3-3σ复合体介导中心体扩增。功能蛋白质组学研究发现,T2DM通过增强14-3-3σ的表达来促进中心体扩增,而JNK1-Stat3也通过14-3-3σ负向调控了中心体扩增。在本研究中,进一步研究了T2DM在生理病理条件下,14-3-3σ的特征及其相互作用的蛋白质。采用免疫共沉淀联合质谱分析,确认了与14-3-3σ互作的134个蛋白质,其中包括70kDa热休克蛋白4(Hsp74)。GO分析显示,这些蛋白质中有许多具有丰富的结合活性。KEGG分析显示,处于前3位的富集途径为核糖体、碳代谢和氨基酸生物合成。分子和功能的研究揭示,实验处理后增加了14-3-3σ/Hsp74的表达和绑定以及中心体扩增。但是,使用siRNA-14-3-3σ和siRNA-Hsp74处理后,抑制了处理组增加的表达、绑定和中心体扩增。此外,分子对接分析表明,14-3-3σ/Hsp74相互作用,主要是通过疏水作用力和一个较小程度上离子键和氢键。总之,研究结果表明,T2DM通过14-3-3σ和Hsp74的表达和绑定引起了中心体扩增。第四部分:脑胶质瘤中心体的异常扩增及其和疾病分期的相关性。研究报道,在各种类型的肿瘤中均发现了中心体扩增。但是,关于中心体扩增与脑胶质瘤的关系及其与疾病分期的相关报道还很少。因此,本研究使用HE染色法,将收集到的40例胶质瘤标本和10例正常脑组织标本进行分级;使用免疫组织化学法检测了Ki67和γ-tubulin蛋白表达。结果表明,Ki67在正常脑组织中没有表达,但在/级、级和V级中,阳性表达率分别为65%、80%和100%,各组间差异具有统计学意义(P0.01),说明Ki67的表达与胶质瘤级别相关;同时,g-tubulin蛋白在各个标本中的表达率分别为:30%、50%、80%和100%,各组间差异具有统计学意义(P0.01),说明胶质瘤级别升高,中心体扩增率增加;使用免疫荧光检测各级别组织标本发现,中心体扩增率和脑胶质瘤的级别呈正相关。总而言之,中心体扩增是脑胶质瘤的恶性程度的特征之一,并且与胶质瘤发病阶段有关,提示中心体扩增和脑胶质瘤的发展具有密切的相关性。综上所述,本研究发现,T2DM的病理生理条件引起了细胞中心体的扩增,且揭示了相关的分子机制;在脑胶质瘤中不但发现了中心体的扩增,而且还和疾病的分期相关。因此,中心体扩增分子机制的发现,将有助于开发抑制T2DM引起中心体扩增的方法。本研究有助于阐明T2DM引起中心体扩增的分子机制,但对于是否对癌症的发生有促进作用尚待探索。如果是这样,那么抑制中心体扩增对T2DM患者的癌症预防将具有非常重要的意义。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.1
【图文】：

中心体

2图 1.1 中心体的结构[6]A：中心体结构模式图；B：电镜下的中心体结构Fig. 1.1 The structure of centrosomeA: Schematic picture of centrosome; B: Electron micrograph of centrosome1.2 中心体的复制众所周知，在有丝分裂的过程中，染色体总是忠实的分离到两个子细胞中，这对于维持大多数（不是所有）生物体的遗传稳定性是至关重要的[7]。中心体和有丝分裂微管之间的相互作用导致了染色体精确地分离到两个子细胞中。细胞分裂后每个子细胞中只含有一个中心体；就像 DNA 一样，中心体在每个细胞周期中只能复制一次。中心体复制必须严格控制，因为每个母中心粒产生一个以上的中心粒就会导致中心体扩增的出现，从而导致细胞遗传物质的不稳定。对于中心体复制周期的观察，最早是通过电子显微镜确定的，根据细胞周期中中心粒对的形态来确定中心体复制周期。近年来，在非洲爪蟾蜍卵提取物和培养的哺乳动物

连接图,着丝粒,微管,连接图

维连接两个姐妹染色单体的着丝粒）是错误的连接状态（图 1.2）。由于缺少连接以及姐妹着丝粒间缺少张力，syntely 和 monotely 连接方式激活了 SAC。如果完成了所有着丝粒的连接，满足了 SAC 的检测，则会启动有丝分裂的后期[24]。先前 Vogelstein 等人为了检测染色体不稳定性的结直肠癌细胞系中 SAC 的保真度，使用诺考达唑干扰微管，来测定这些细胞的有丝分裂指数。结果证明，在诺考达唑引起染色体不稳定性的结肠直肠癌细胞系中，染色体不稳定性不会引起明显的有丝分裂阻滞，提示染色体不稳定性细胞缺乏一个积极检测的 SAC[25]。但是，后续的研究发现，染色体不稳定性细胞常表现为染色体滞后和后期桥接[26]。进一步研究发现，这些表型是另一种错误的微管-着丝粒连接类型（merotely）引起的。Merotely 是纺锤体两极的微管纤维连接一个着丝粒，重要的是，由于微管纤维连接到所有的着丝粒上，产生了足够的张力，造成了 SAC 并没有检测到这个错误连接（图 1.2）。微管连接着丝粒是一个高度动态的过程，依赖于着丝粒与中心体核化的微管之间的距离[27]。这导致额外的中心体和/或染色体的存在延长了纺锤体组装的过程[28]。

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