长链非编码RNA-MALAT1在糖尿病性视网膜微血管病变过程的调控作用研究

发布时间：2020-07-01 14:04

【摘要】：目的:探讨长链非编码RNA-肺腺癌转移相关转录物1(long non coding RNA-metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1,lnc RNA-MALAT1)在糖尿病性视网膜微血管病变中的作用及其机制。方法:(1)单次腹腔注射链脲霉素(Streptozocin,STZ)构建大鼠糖尿病模型,RT-PCR检测糖尿病大鼠、野生型大鼠的视网膜以及先天糖尿病小鼠、野生型小鼠视网膜中MALAT1的表达。细胞实验,采用原位杂交技术检测猴视网膜血管内皮细胞(RF/6A)的MALAT1的表达情况。(2)野生型大鼠及糖尿病大鼠眼内注射MALAT1 sh RNA或Scr sh RNA腺病毒,RT-PCR验证MALAT1的表达下调。采用视觉电生理(ERG)检测MALAT1的下调对大鼠视觉功能的影响。采用TUNEL法检测MALAT1下调对大鼠视网膜细胞凋亡的影响。采用视网膜胰酶消化及糖原雪夫染色法检测MALAT1下调对视网膜周细胞缺失及无细胞血管形成的影响。采用伊凡氏蓝-白蛋白染色法检测MALAT1下调对糖尿病大鼠视网膜血管渗漏的影响。采用Western Blotting法检测各组大鼠视网膜中炎症因子细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达情况,以探讨MALAT1下调对糖尿病大鼠的视网膜炎症反应影响。(3)小RNA干扰的方法下调RF/6A细胞中MALAT1的表达后,给予高糖(或H2O2)刺激,采用MTT检测RF/6A细胞的活力;采用Hoechst、JC-1、PI与台盼蓝染色检测细胞的凋亡或死亡情况,以探究MALAT1是否影响高糖诱导的细胞凋亡。VEGF或TNF-α诱导RF/6A细胞迁移和成管,采用细胞划痕法及基质毛细管发生实验分别检测MALAT1下调对细胞迁移和成管能力的影响。(4)采用Western blotting法来检测在高糖刺激和MALAT1下调处理后RF/6A细胞中p38、JNK及ERK1/2的激活情况,探究MALAT1是否通过丝裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路调控视网膜内皮细胞的功能。结果:(1)MALAT1在糖尿病大鼠和小鼠视网膜中表达显著上调。原位杂交结果显示MALAT1在RF/6A细胞核内大量表达。(2)RT-PCR结果显示眼内注射MALAT1 sh RNA腺病毒的糖尿病大鼠视网膜中MALAT1表达水平下调,注射Scr sh RNA腺病毒的没有明显改变。MALAT1表达下调后能减轻糖尿病导致视功能下降及视网膜细胞的凋亡;改善周细胞缺失、无细胞血管的形成及血管渗漏;减少视网膜中ICAM-1、VEGF和TNF-α等炎性因子的表达。(3)高糖或H2O2处理RF/6A细胞后,细胞活力下降,下调MALAT1后,活细胞的活力进一步降低。VEGF或TNF-α处理后RF/6A细胞迁移与成管能力显著增加,MALAT1的下调则降低细胞迁移与成管能力。(4)MALAT1下调导致p38磷酸化水平下降,但对ERK1/2或JNK1/2磷酸化水平没有影响。p38抑制剂SB23580预处理RF/6A细胞后,能阻断MALAT1上调导致RF/6A细胞的活力增加。然而ERK抑制剂或是JNK抑制剂对细胞活性没有影响。结论:MALAT1通过p38-MAPK通路改善糖尿病性视网膜微血管病变。MALAT1有望成为治疗糖尿病性微血管病变的新靶点。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R774.1;R587.2
【图文】：

在糖尿病大鼠模型建立1月、3月、5月后取新鲜视网膜并提取RNA

南京医科大在 RF/6A 细胞核内大量表达 是一种体内组织广泛存在的保守的长链非编码 RNA。 在糖尿病大鼠视网膜中、高糖处理的内皮细胞系 RF水和纤维膜中都显著上调。的功能失调是糖尿病微血管并发症特征性病理变化。 中 RNA 荧光结果显示 MALAT1 在 RF/6A 的细胞核内

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本文编号：2736858