【摘要】：背景:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜组织慢性炎症、软骨与骨渐进性破坏,最终导致关节畸形的自身免疫性疾病,滑膜成纤维细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)“类瘤样”生长是RA发病的中心环节。研究表明,无论是RA患者还是其动物模型Sonic Hedgehog(Shh)信号通路均处于异常激活状态,并通过促进FLSs过度增殖参与了RA的发病,且Ptch1基因高甲基化可使该通路过度激活,针对Shh信号通路的靶向治疗有望作为RA治疗的新策略。间充质干细胞微泡(mesenchymal stem cell microvesicles,MSC-MVs)是间充质干细胞(MSCs)体外培养基中分离的可溶性生物媒介,其不仅具有促进机体损伤组织的修复、抑制炎症反应和调节免疫反应的功能,还可规避直接体内注射活细胞带来的不利生物学效应。前期研究证实,人脐带间充质干细胞微泡(h UCMSC-MVs)移植可改善RA动物模型---胶原诱导关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠的关节炎症状、影像学及病理表现,并可以调节RA患者免疫紊乱。但h UCMSC-MVs对RA-FLSs功能的影响以及其作用机制目前尚不明确。目的:探讨h UCMSC-MVs对RA-FLSs增殖、凋亡、迁移能力的影响,进一步深入研究h UCMSC-MVs对RA-FLSs的影响是否通过靶向Shh信号通路,以及h UCMSC-MVs对Shh信号通路的影响是否是通过靶向Ptch1基因甲基化水平实现的。从细胞、蛋白、基因层面研究其分子机制,进一步揭示h UCMSC-MVs治疗RA的机制,为h UCMSC-MVs在RA的临床转化提供理论依据和实验基础。方法:1.h UCMSC-MVs获取及鉴定:购买h UCMSCs细胞系第1代,复苏培养传代至第4-5代用于实验。通过对h UCMSCs进行“饥饿”处理,差速离心条件培养基获取h UCMSC-MVs,从形态学、蛋白浓度及表面分子表达3方面进行鉴定。2.FLSs的获取及鉴定:购买人RA滑膜成纤维细胞系(MH7A)第4代,传代后用于实验。无菌条件下收集骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者滑膜组织,将组织剪至乳糜状,胰蛋白酶消化法处理细胞,接种于DMEM培养液中。3-4天换液,细胞贴壁90%左右传代,选取第4-5代用于实验。流式细胞术检测OA-FLSs细胞表面标记分子CD14、CD45、CD90。3.实验分组:(1)检测RA-FLSs功能分组:分为RA空白对照组、Cyclopamine(Shh信号通路抑制剂)干预组、5-Azadc(DNA甲基化抑制剂)干预组、不同浓度h UCMSC-MVs干预组(10μg/μL、50μg/μL、100μg/μL、150μg/μL、200μg/μL);(2)检测Shh信号通路分子表达分组:分为OA组、RA空白对照组、Cyclopamine干预组、5-Azadc干预组、h UCMSC-MVs干预组。4.检测方法:(1)CCK8法检测各组细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,划痕试验比较各组细胞迁移情况;(2)Western blot法检测各组Shh信号通路相关蛋白Shh、Gli1、Ptch1表达情况,Real-time PCR法检测各组相关基因SHH、GLI1、PTCH1m RNA表达情况。结果:1.h UCMSC-MVs获取及鉴定:通过梯度离心法获取h UCMSC-MVs,并成功对其进行鉴定。h UCMSC-MVs直径多数介于40nm-300nm,茶托样,具有脂质双分子层结构,重悬后蛋白质浓度约为2.00μg/μL,Western blot鉴定表面分子表达CD63和Hsp70。符合其鉴定标准,为进一步深入研究提供了依据。2.OA-FLSs的获取及鉴定:本实验成功分离培养OA-FLSs,经流式细胞鉴定其表面分子CD90表达率90%,CD14和CD45表达率1%,符合FLSs鉴定标准。3.h UCMSC-MVs对RA-FLSs功能的影响:1)h UCMSC-MVs对RA-FLSs增殖的影响:(1)与RA空白对照组相比,h UCMSC-MVs 10μg/m L、50μg/m L、100μg/m L干预组RA-FLSs增殖率明显升高(P0.001、P0.001、P0.001),150μg/m L和200μg/m L干预组增殖率较RA空白对照组降低(P0.001、P0.001),且150μg/m L与200μg/m L干预组之间RA-FLSs增殖率无明显差异(P0.05);(2)与RA空白对照组相比,Cyclopamine干预组与5-Azadc干预组RA-FLSs增殖率明显降低(P0.001、P0.001);h UCMSC-MVs 150μg/m L干预组与Cyclopamine干预组相比,FLSs增殖率下降(P0.001),同时,h UCMSC-MVs 150μg/m L干预组与5-Azadc干预组FLSs增殖率无明显差异(P0.05)。选取h UCMSC-MVs 150μg/m L干预组用于后续实验。2)h UCMSC-MVs对RA-FLSs凋亡的影响:与RA空白对照组相比,Cyclopamine干预组、5-Azadc干预组及h UCMSC-MVs干预组RA-FLSs凋亡率明显升高(P0.01、P0.01、P0.01),h UCMSC-MVs干预组与其他各干预组之间凋亡率无明显差异(P0.05);3)h UCMSC-MVs对RA-FLSs迁移的影响:(1)在干预12h后,与RA空白对照组相比,Cyclopamine干预组、5-Azadc干预组和h UCMSC-MVs干预组RA-FLSs迁移率均减低(P0.001、P0.01、P0.05);Cyclopamine干预组迁移率较5-Azadc干预组和h UCMSC-MVs干预组明显减低(P0.01、P0.001),5-Azadc干预组和h UCMSC-MVs干预组之间迁移率无明显差异(P0.05);(2)在干预24h后,与RA空白对照组相比,Cyclopamine干预组、5-Azadc干预组和h UCMSC-MVs干预组RA-FLSs迁移率均减低(P0.001、P0.001、P0.01);Cyclopamine干预组迁移率较5-Azadc干预组和h UCMSC-MVs干预组明显减低(P0.001、P0.001),5-Azadc干预组较h UCMSC-MVs干预组迁移率减低(P0.001);(3)在干预48h后,与RA空白对照组相比,Cyclopamine干预组、5-Azadc干预组RA-FLSs迁移率减低(P0.001、P0.05);h UCMSC-MVs干预组与RA空白对照组相比迁移率无明显差异(P0.05)。4.h UCMSC-MVs对RA-FLSs Shh信号通路的影响:1)蛋白表达水平:(1)与OA组相比,RA空白对照组Shh、Gli1蛋白表达明显升高(P0.001、P0.001),Ptch1蛋白表达水平无明显差异(P0.05);(2)与RA空白对照组相比,Cyclopamine干预组、5-Azadc干预组和h UCMSC-MVs干预组Shh蛋白表达均减低(P0.05、P0.05、P0.01);各干预组之间Shh蛋白表达无明显差异(P0.05)(3)与RA空白对照组相比,Cyclopamine干预组、5-Azadc干预组和h UCMSC-MVs干预组Gli1蛋白表达均减低(P0.05、P0.05、P0.001);与Cyclopamine干预组相比h UCMSC-MVs干预组Gli1蛋白表达明显减低(P0.05);5-Azadc干预组和h UCMSC-MVs干预组之间Gli1蛋白表达无明显差异(P0.05)(4)各干预组与RA空白对照组相比Ptch1蛋白表达无明显差异(P0.05);4)m RNA表达变化:(1)与OA组相比,RA空白对照组SHH、GLI1 m RNA表达增加(P0.05、P0.05),PTCH1 m RNA表达减低(P0.05);(2)与RA空白对照组相比,Cyclopamine干预组、5-Azadc干预组和h UCMSC-MVs干预组SHH m RNA表达减低(P0.001、P0.01、P0.01),余各组之间SHH m RNA表达无明显差异(P0.05)。(3)与RA空白对照组相比,Cyclopamine干预组、5-Azadc干预组和h UCMSC-MVs干预组GLI1 m RNA表达均减低(P0.05、P0.05、P0.05),各干预组间GLI1 m RNA表达无明显差异(P0.05);(4)与RA空白对照组相比,Cyclopamine干预组、5-Azadc干预组和h UCMSC-MVs干预组PTCH1 m RNA表达均升高(P0.001、P0.05、P0.05);Cyclopamine干预组PTCH1 m RNA表达较5-Azadc干预组和h UCMSC-MVs干预组升高(P0.001、P0.001),5-Azadc干预组和h UCMSC-MVs干预组之间PTCH1 m RNA表达无差异(P0.05);结论:1.本实验所获得的h UCMSC-MVs及OA-FLSs符合其鉴定标准;2.Shh信号通路的异常激活促进RA-FLSs的增殖、迁移,并抑制其凋亡;3.Ptch1甲基化水平升高介导了Shh信号通路的异常激活;4.h UCMSC-MVs可能通过抑制Shh信号通路的激活以及Ptch1基因甲基化影响RA-FLSs的功能。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R593.22
【图文】：
组别X SFRA 空白对照组 1.000±0.000106.5Cyclopamine 干预组 0.835±0.051a5-Azadc 干预组 0.723±0.048achUCMSC-MVs 10μg/mL 1.300±0.016ahUCMSC-MVs 50μg/mL 1.205±0.058ahUCMSC-MVs 100μg/mL 1.273±0.036ahUCMSC-MVs 150μg/mL 0.727±0.042achUCMSC-MVs 200μg/mL 0.766±0.056ab注：采用 LSD 法进行两两比较；a 表示各干预组与 RA 空白对照预组与 Cyclopamine 干预组比较 P<0.05，c 表示各干预组与 CyclopRA
MSC-MVs 可促进 FLSs 的凋亡 RA 空白对照组相比，Cyclopamine 干预组、5-AzadcLSs 凋亡率明显升高（P<0.01、P<0.01、P<0.01）；干预组之间 FLSs 凋亡率无明显差异（P>0.05）（LSD法进行两两比较；a表示各干预组与RA空白对照组比较表 1-3 各干预组 FLSs 凋亡率组别凋亡率X SF 对照组 2.440±0.28210.368 mine 干预组 5.840±0.590a 干预组 5.760±0.918bC-MVs 干预组 6.227±1.525b
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 范久亿;李军;丁士刚;;Wnt信号通路在结直肠侧向发育型肿瘤中的研究进展[J];胃肠病学;2018年11期
2 王雪;张评浒;;Ras/Raf/MEK/ERK信号通路参与自噬调控作用的研究进展[J];中国药科大学学报;2017年01期
3 许莹萍;王菲菲;李大金;王凌;;雌激素-雌激素受体信号通路对趋化因子的调控作用研究进展[J];生殖医学杂志;2017年09期
4 苏依拉其木格;;Hedgehog信号通路在肺癌中的研究进展[J];健康之路;2016年09期
5 滕振平;邢飞跃;;细胞外信号调节激酶1/2信号通路对B淋巴细胞的影响[J];中国药物与临床;2007年01期
6 杜婵;姜保国;;许旺细胞增殖和分化过程中的信号通路[J];中国组织工程研究与临床康复;2007年03期
7 史琳琳;赵锋;高学军;李庆章;;乳蛋白合成信号通路的研究进展[J];中国畜牧兽医;2013年01期
8 舒扬;向敏;;Wnt信号通路在中枢神经系统中的作用及相关机制[J];江苏医药;2018年08期
9 刘晓光;陈佩杰;肖卫华;;Wnt信号通路在骨骼肌损伤修复过程中的作用及机制研究[J];生命的化学;2018年05期
10 刘艳芳;吴志远;;分子信号通路在瘢痕疙瘩中的研究进展[J];海南医学;2017年07期
相关会议论文 前10条
1 彭丽;章杰;刘伟;;病理性瘢痕相关信号通路的研究进展[A];2015江西省首届医学美容整形联合学术会议、江西省医学会第十一次医学美学与美容学术研讨会、江西省第四次中西医结合医学美容学术会议论文汇编[C];2015年
2 曾令启;叶章群;陈志强;杨为民;高文喜;;草酸激活人肾小管上皮细胞p38 MAPK信号通路的研究[A];中国中西医结合学会泌尿外科专业委员会第十四次全国学术会议暨2016年广东省中西医结合学会泌尿外科专业委员会学术年会论文集[C];2016年
3 王俊成;;炎症因子对成骨细胞分化过程中BMP信号通路的的影响[A];中华口腔医学会口腔修复学专业委员会第十次全国口腔修复学术大会论文集[C];2016年
4 苟黎明;李春洁;李龙江;;经典Wnt信号通路在下颌下腺分支形态发生过程中的作用与机制的初步研究[A];2017全国口腔颌面——头颈肿瘤外科学术研讨会论文集[C];2017年
5 谢玲;项晓琼;胡迎春;范宝星;霍艳英;李邦印;段瑞峰;张开泰;吴德昌;;细胞定位与信号通路检测技术在hrnt-1基因功能研究中的应用[A];中华医学会放射医学与防护学分会第三次全国中青年学术交流会论文汇编[C];2001年
6 苟黎明;李春洁;李龙江;;经典Wnt信号通路在下颌下腺分支形态发生过程中作用与机制的初步研究[A];第十四次中国口腔颌面外科学术会议论文汇编[C];2018年
7 林泓域;Yimon Aye;;Wnt信号通路与Nrf2信号通路之间的微妙关系——靶向化学平台T-REX在氧化还原信号通路研究方面的应用[A];第十届全国化学生物学学术会议论文摘要集（墙报）[C];2017年
8 张丽琳;常娜;蒋伶活;;镉胁迫下MAPKs信号通路的应答机制初探[A];第九届中国模式真菌研讨会摘要集[C];2016年
9 孙宏亮;许美花;王瑶;鲁文赓;;Wnt信号通路在牛胎盘发育过程中的功能[A];中国畜牧兽医学会兽医产科学分会第十三次学术研讨会论文集[C];2016年
10 陈娉婷;周小青;刘旺华;曹泽标;陈昱文;;中药对神经干细胞增殖分化相关信号通路调控研究进展[A];第九次全国中西医结合诊断学术研讨会论文集[C];2015年
相关重要报纸文章 前10条
1 本报记者 白毅;mTOR信号通路为肿瘤治疗提供新靶点[N];中国医药报;2010年
2 记者 王丹;最强激光“照亮”药靶重要信号通路[N];健康报;2015年
3 ;完美实现信号通路间的自由切换[N];通信产业报;2008年
4 本报特约撰稿 樊平;肿瘤信号通路靶点研发线吸睛[N];医药经济报;2018年
5 衣晓峰 陈英云 记者 李丽云;结肠癌发生中新的信号通路找到[N];科技日报;2009年
6 刘海英;美发现两种细胞信号通路互动机制[N];科技日报;2009年
7 衣晓峰;哈医大发现结肠癌发生中新的信号通路[N];中国医药报;2009年
8 记者 刘海英;英发现细胞信号通路新“刹车”蛋白[N];科技日报;2012年
9 中山大学肿瘤医院血液肿瘤科 吕跃 王华;难治性HL研究砥砺前行[N];医药经济报;2013年
10 刘禹 记者 王春;个体衰老速度差异谜团揭开[N];科技日报;2017年
相关博士学位论文 前10条
1 孙明慧;靶向激活ERK1/2信号通路防治动脉硬化性心肌缺血再灌注损伤的作用机制研究[D];新疆医科大学;2019年
2 石欢;TLR9信号通路异常在舍格伦综合征发病机制中的作用研究[D];上海交通大学;2017年
3 张辉;Erythropoietin信号通路对成体大鼠脊髓内源性神经干细胞增殖分化作用的实验研究[D];安徽医科大学;2018年
4 吴慧;活性多肽的表达及功能研究[D];国防科学技术大学;2017年
5 韩晶晶;Nrf2信号通路在急性移植物抗宿主病中的作用及机制研究[D];苏州大学;2018年
6 朱建伟;MAPK/纤调蛋白信号通路在氧化应激介导慢性胰腺炎纤维化中的机制研究[D];中国人民解放军海军军医大学;2018年
7 孙海涛;NF-κB P65通过Wnt信号通路调控HSCs活化的分子机制及鳖甲寡肽I-C-F-6的干预作用[D];南方医科大学;2018年
8 鲁茜;TGF-β1/PI3K/Akt信号通路在糖尿病肾病中的作用[D];南京医科大学;2013年
9 王凡;HIF-1信号通路在多囊卵巢综合征中的作用及其调控机制[D];福建师范大学;2017年
10 肖华;吡非尼酮抑制Hedgehog信号通路延缓肺纤维化[D];南方医科大学;2018年
相关硕士学位论文 前10条
1 黄蓓;显微镜下多血管炎T淋巴细胞TLR/MyD88信号通路基因差异性表达特征的研究[D];广西医科大学;2018年
2 李婷;柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎模型大鼠JNK/P38MAPK信号通路的影响[D];西南医科大学;2019年
3 何梅;Wnt/β-catenin信号通路和p38信号通路对bFGF维持人根尖牙乳头干细胞干性的影响[D];遵义医科大学;2019年
4 吴晓玲;雌激素通过Wnt信号通路调控人牙周膜干细胞成骨分化的研究[D];西南医科大学;2019年
5 董智琦;炎症趋化因子CCL1、CCL20、CXCL5在肝癌细胞中对相关信号通路关键蛋白磷酸化的影响[D];遵义医科大学;2019年
6 杨然;基于全转录测序探讨Masquelet诱导膜促进成骨的机制与HIF-α通路的关系[D];西南医科大学;2019年
7 谭豆豆;JAK2/STAT3信号通路的调控对食管癌侵袭转移作用的研究[D];新疆医科大学;2019年
8 于景霞;JAK/STAT3和TGF-β1信号通路串话对大鼠肝癌发展的影响[D];上海交通大学;2017年
9 赵枫;JNK信号通路基因多态性与妊娠期糖尿病的关系[D];山西医科大学;2019年
10 苏雅珍;人脐带间充质干细胞微泡对类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞功能及Shh信号通路影响的研究[D];山西医科大学;2019年
本文编号：
2739439
